基于網絡藥理學和分子對接探究腎康注射液治療糖尿病腎病作用機制

方錦穎,王一沖,神原優滋(日本)，李文歌，3

(1.北京中醫藥大學，北京100029；2.北京大學醫學部，北京100191；3.中日友好醫院腎病科，北京100029)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見微血管并發癥，以高血壓、蛋白尿、腎功能下降，最終導致腎衰竭為主要表現。目前DN是導致終末腎臟病(End-stage renal disease，ESRD)的首要原因[1-2]。中醫藥在DN治療中起著重要作用[3]。中醫理論中，DN病機以氣陰兩虛為本，“瘀”是其重要致病因素，益氣養陰、活血化瘀已成為治療DN的重要原則[4]。腎康注射液由黃芪、丹參、大黃、紅花的提取物組成，具有通腑泄濁、活血化瘀、補氣利濕等功效[5]。近年來，臨床常應用腎康注射液延緩DN進展，療效較好。現代藥理學發現腎康注射液具有改善脂代謝，糾正淋巴細胞紊亂，抑制免疫炎癥反應，抑制腎小球系膜細胞增生，減緩腎臟纖維化，延緩腎小球硬化等作用[6-8]。中藥制劑成分復雜，作用機制多樣，對于腎康注射液治療DN的通路缺乏系統性認識。網絡藥理學基于系統生物學相關理論，聯合數據庫，通過“藥物-有效成分-靶點-疾病”的方式，研究藥物治療疾病作用機制[9-10]。本文運用網絡藥理學方法，結合文獻研究、數據發掘、統計分析等手段，收集腎康注射液有效成分、作用靶點及DN靶點等，構建腎康注射液與DN相互作用網絡，探究腎康注射液治療DN作用機制。

1 資料與方法

1.1 文獻來源與分析平臺 TCMSP數據庫、Uniprot數據庫、Genecards數據庫、Active Perl軟件、String數據庫、PDB數據庫、Cytoscape 3.6.1軟件、R3.6.2軟件、Discovery studio軟件、Pymol軟件、Autodock軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 腎康注射液有效成分的收集及篩選：通過TCMSP數據庫，收集丹參、紅花、大黃及黃芪的主要活性成分。根據Lipinski五規則及相關文獻[11]對成分毒藥物動力學參數進行設置，篩選出在人體內生物活性較高的成分，篩選條件為藥物相似性(DL)≥0.18、分配系數≤5、氫鍵給體≤5、氫鍵受體≤10。

1.2.2 收集腎康注射液相關靶點：通過TCMSP數據庫篩選出腎康注射液的所有作用靶點，通過Active Perl軟件篩選后，得到藥物活性成分的對應靶點。進一步使用Uniprot數據庫對藥物靶點信息進行規范化處理，查找蛋白質名稱，限定物種為人，獲取唯一的Uniprot ID，得到藥物靶點ID。

1.2.3 收集DN相關靶點：從Genecards數據庫獲取與DN相關的靶點，并導入Uniprot數據庫的相應Uniprot ID，得到疾病靶點ID。

1.2.4 收集腎康注射液與DN共同靶點：通過R3.6.2軟件，將前期獲得的腎康注射液靶點及DN相關的靶點取交集，得到腎康注射液與DN共同靶點。

1.2.5 “藥物-有效成分-靶點-疾病”網絡構建：將藥物-疾病共同靶點及藥物靶點基因ID通過Active Perl軟件，獲得network文件，type文件，藥物有效成分3個文件。3個文件通過Cytoscape 3.6.1軟件獲得藥物-有效成分-靶點-疾病網絡，并對其進行注釋及美化。

1.2.6 蛋白質互作(Protein-protein interaction，PPI)網絡構建：PPI網絡是由蛋白通過彼此之間的相互作用，來參與調節基因表達、傳遞生物信號、物質及能量代謝、調控細胞周期等生命過程的各個環節[12]。通過String數據庫，輸入前期獲得的共同靶點信息，物種選擇Homo sapiens(智人)，選擇置信度得分>0.90以確保結果的準確性，去除獨立的基因，構建PPI網絡。通過R3.6.2軟件得到PPI網絡核心基因。

1.2.7 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析：功能富集分析是將基因或者蛋白列表分成多個部分，即將獲得的基因根據功能或其他標準進行分類，將具有相似功能的基因放到一起，并將其與生物學表型關聯起來[12]。使用前期獲得的共同靶點，通過R3.6.2軟件、Active Perl軟件對靶點基因進行富集分析，包括GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，設定P<0.05并使用Bonferroni檢驗法進行校正，并篩選出具有統計學意義的生物學過程和信號通路。

1.2.8 分子對接：選擇PPI網絡中Degree值最大的10個靶點作為受體，與納入研究的腎康注射液活性成分進行分子對接。在PDB數據庫下載受體的人源性蛋白結構，逐一導入Discovery studio軟件進行分子結構常規預處理。TCMSP數據庫下載腎康注射液主要各活性成分的SDF三維結構作為配體，導入Pymol軟件、Autodock軟件進行常規預處理，并逐一對主要藥物活性成分和配體進行對接，制作熱力圖。

2 結 果

2.1 腎康注射液有效成分及靶點的收集及篩選 通過TCMSP數據庫檢索并通過設置ADME參數篩選后得到大黃有效成分16個、丹參有效成分65個、紅花有效成分22個、黃芪有效成分20個，篩選重復后得到有效成分共120個。通過TCMSP數據庫、Active Perl軟件獲得上述有效成分的作用靶點，除去重復靶點后，共得到有效成分對應靶點2219個，同時在Uniprot數據庫中查找主要活性成分作用靶點的相應Uniprot ID，去除重復和非人源靶點，得到1948個靶點，即藥物靶點ID。

2.2 DN靶點篩選 從Genecards數據庫共收集到與DN相關的靶點4444個，將靶點名導入Uniprot數據庫，獲得4444個Uniprot ID 。

2.3 腎康注射液與DN共同靶點 通過R3.6.2軟件，將前期獲得的腎康注射液靶點及DN相關的靶點取交集，得到183個腎康注射液與DN共同靶點。

2.4 “藥物-有效成分-靶點-疾病”網絡圖構建 將腎康注射液與DN共同靶點及藥物靶點基因ID通過Active Perl軟件、Cytoscape 3.6.1軟件獲得藥物-有效成分-靶點-疾病網絡。其中橘色節點表示腎康注射液有效成分有37種；綠色節點表示DN和腎康注射液交集靶點184個；紅色節點代表DN；黃色節點代表腎康注射液(圖1)。

圖1 “藥物-有效成分-靶點-疾病”網絡圖

2.5 PPI網絡構建 通過String數據庫，輸入前期獲得的疾病-藥物交集靶點，物種選擇智人(Homo sapiens)，設置置信系數>0.9，去除獨立的基因，構建PPI網絡，共有基因167個，連線718條(圖2)。

圖2 腎康注射液有效成分與DN共同靶點PPI網絡圖

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將腎康注射液與DN的183個共同靶點通過R3.6.2軟件進行GO功能富集分析，共得到169條生物過程，主要涉及免疫炎癥反應、代謝通路等生物學過程(圖3)。KEGG信號通路富集分析結果，共得到174條信號通路，通過KEGG數據庫進一步查找信號通路相關信息及通路圖，其中與DN相關的通路59條，主要涉及免疫炎癥反應、能量代謝調節、自噬等(圖4)。

圖3 腎康注射液與DN共同靶點GO功能富集分析氣泡圖

2.7 分子對接 選取PPI網絡中“Degree”值最大10個靶點，與腎康注射液的6個主要活性成分進行分子對接，對接得分經過熱力圖分析得出結果。其中，對接得分≤-9.0 kcal/mol的成分有3個，占5.0%，其余對接得分均在-9.0～-5.0 kcal/mol之間(圖5)。一般認為對接得分≤-5.0 kcal/mol時，藥物活性成分與靶點具有較好的結合活性，因此腎康注射液的主要活性成分與重點靶點之間具有較好的結合能力。同時，發現甲基黃連堿(Worenine)與目標靶點對接得分均≤-7.0 kcal/mol，其中30 %對接得分≤-9.0 kcal/mol。JUN、絲裂原激活蛋白激酶8(Mitogenactivated protein kinases 8，MAPK8)、APP與所有主要藥物活性成分結合分數均≤-7.0 kcal/mol。由此推測甲基黃連堿等成分可能是腎康注射液治療DN的有效成分，MAPK8、APP可能是其主要作用靶點。

3 討 論

DN發病機制與免疫炎癥、血流動力學改變、氧化應激、代謝紊亂、遺傳等因素有關[13-14]。中醫認為DN病機以臟腑內虛為本，瘀血痰濁為標，治療上根據辨證，采用補虛活血瀉濁、益氣活血、補腎化瘀、化瘀散結等方法[15]。腎康注射液能夠兼顧DN患者本虛標實的特點，一定程度上減少DN患者的尿蛋白，改善腎功能，延緩疾病進一步發展。腎康注射液中黃芪益氣袪濕，丹參、紅花的提取物具有活血化瘀的功效，大黃通腑泄濁，對于DN氣血運行不暢形成濁邪具有良好的治療效果。本文通過網絡藥理學的方法構建腎康注射液治療DN的“藥物-有效成分-靶點-疾病”網絡，對其涉及的信號通路及生物學過程進行分析，發現腎康注射液治療DN是通過多途徑發揮作用。涉及的主要生物學過程有免疫炎癥反應、能量代謝、水鹽代謝調節、改善局部微循環、調控細胞周期等。通過分子對接發現，腎康注射液6個主要活性成分均能與DN的10個主要靶點結合，腎康注射液可能通過JUN、MAPK8、APP等靶點，調節免疫炎癥反應、凋亡等通路，延緩DN進展。

DN患者常合并代謝綜合征，高血糖、高脂血癥、高尿酸血癥等代謝疾病又進一步加重腎臟損傷。在高血糖狀態下，人體產生不可逆糖化蛋白質即晚期糖基化終產物(AGEs)。當AGEs不能完全被腎臟近端小管內吞、溶酶體降解時，AGEs大量積累，促進炎癥因子釋放，激活炎癥反應，促使糖尿病腎病發生發展[14]。血管內皮生長因子B(VEGF-B)在DN患者體內高水平表達，腎臟脂肪變性，抑制VEGF-B信號傳導可降低腎臟的脂毒性，提高足細胞對胰島素信號敏感性，延緩DN進展[14，16]。腎康注射液可通過調節VEGF-B等信號傳導，降低腎臟的脂毒性。血壓控制不佳是導致DN進展的重要因素，腎康注射液通過作用于RAAS系統起到一定的調節血壓作用[16]。網絡藥理學研究表明，腎康注射液中鼠李檸檬素、野黃芩素等有效成分可以作用于表皮生長因子受體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、血管內皮生長因子A等靶點基因，通過血管內皮生長因子信號通路、脂肪細胞素信號通路、胰島素信號通路等16條信號通路，從改善胰島功能、提高機體對胰島素敏感性、調節腎臟局部血壓等多方面改善DN患者代謝紊亂，減少尿蛋白，延緩腎臟衰竭。

炎癥反應在DN發病過程中處于重要地位。白介素-18、白介素-1β、Toll樣受體-2等炎癥因子造成全身和局部低度炎癥與DN的發生發展密切相關，且在調節免疫紊亂中發揮重要作用。血管內皮蛋白酪氨酸磷酸酶與糖尿病并發癥的發展有關，抑制血管內皮蛋白酪氨酸磷酸酶表達，減少促炎和纖維化基因靶點表達，延緩DN進展[17-18]。腎康注射液中決明內酯、6-羥基山柰酚、澤蘭黃醇、熊竹素等作用于一氧化氮合酶-3、白介素-6、核受體共激活劑-2、MAPK-8等靶基因，通過T淋巴細胞、腫瘤壞死因子、Toll樣受體信號通路等，調節人體免疫反應，減少炎癥因子產生。

自噬在多種急慢性腎臟疾病中起著重要作用，可與細胞凋亡、能量代謝、免疫炎癥反應等過程相互影響。有研究表明，在DN模型小鼠出現內皮細胞特異性自噬缺陷后可加重蛋白尿，導致疾病惡化[19]。同時內皮細胞特異性自噬缺陷的小鼠對高糖高脂飲食耐受性下降，易出現腎功能受損。自噬通過降解AGEs，提高溶酶體活性，減輕炎癥反應，保護足細胞。腎康注射液通過酪氨酸激酶抑制劑抵抗相關信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信號通路等減輕腎臟損傷。