食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達變化及意義

夏秀麗，趙樹山，宋曉明，李云，徐珊，程麗敏，徐超

1邯鄲市中心醫院消化內科，河北邯鄲 056001；2邯鄲市中心醫院普外科；3邯鄲市中心醫院病理科

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。我國是食管癌的高發國家，據統計，我國每年新發食管癌病例超過25萬例，每年因食管癌死亡的患者約20.6萬例[1]。食管癌主要分為鱗癌和腺癌兩種組織類型，其中鱗狀細胞癌占全部食管癌的90%以上[2]。近年來，隨著診療技術的不斷發展，多數食管癌患者可得到有效治療，但患者的遠期預后仍有待提高。微小RNA(miR)是一類內源性非編碼的小RNA分子，可與信使RNA的3′開放區互補結合，起到調控基因轉錄的作用。研究證實，miR在腫瘤發生發展中發揮重要作用[3]。miR-145、miR-765均與腫瘤發生有關。有研究報道，miR-145可抑制胃癌細胞的遷移、侵襲[4]；miR-765則可促進乳腺癌的發生發展[5]。因此推測，miR-145、miR-765可能與食管鱗狀細胞癌細胞增殖和患者預后密切有關。2015年1月—2017年12月,我們探討了食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2017年12月我院收治的食管鱗狀細胞癌患者80例。納入標準：①符合美國國立綜合癌癥網絡制定的食管癌診斷標準[6]，并經手術切除后病理診斷為食管鱗狀細胞癌；②患者第一次罹患惡性腫瘤，本次治療為初次就診，且手術前未經其他抗腫瘤治療；③患者臨床資料完整，均擇期完成手術且保留癌組織和癌旁組織標本；④患者或其家屬對本研究知情同意。排除標準：①同時發現其他器官、系統發生惡性腫瘤者；②疾病嚴重，預計生存期<6個月者；③近6個月內發生感染性疾病者；④合并內分泌系統、免疫系統疾病者；⑤不具備手術指征者。80例患者中男49例、女31例，年齡44～80(61.37±8.42)歲；組織分化程度：低分化13例、中分化19例、高分化48例；TNM分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期32例、Ⅲ期36例。本研究經醫院倫理委員會批準(LS-HDZX201412)。

1.2 食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中miR-145、miR-765表達檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法。取患者術中切取的癌組織及癌旁組織標本，并將標本冰上研磨，TRIzol法提取組織總RNA，再經分光光度計測量光密度值后進行反轉錄，生成總cDNA，應用TaqMan MicroRNA assay試劑盒進行擴增反應。引物序列由蘇州吉瑪生物科技有限公司合成。miR-145正向引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAAT-3′，反向引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miR-765正向引物5′-GCCTGGAGGAGAAGGAA-3′，反向引物5′-GTGGAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′，反向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′。反應體系：cDNA 1 μL，PCR primer 0.5 μL，2 Master 10 μL，20 SYBRI 1 μL，H2O 7.5 μL，共計20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，55 ℃延伸20 s，共計40個循環。以U6為內參，通過2-ΔΔCt法計算miR-145、miR-765相對表達量，進行3次平行試驗，取其平均值。

1.3 食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中增殖指數(PI)測算 采用免疫組化法。將癌組織和癌旁組織標本按7點法取材，浸入10%中性甲醛中固定，常規石蠟包埋，制成連續切片，采用SABC免疫組化法染色，常規二甲苯脫蠟后分別浸入梯度乙醇中進行水化，PBS緩沖液沖洗，高溫高壓抗原修復，消化內源性過氧化物酶，滴加山羊血清封閉抗原，加入兔抗人增殖細胞核抗原單克隆抗體，飽和濕度過夜，加入生物學二抗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替生物學一抗作為陰性對照，以試劑盒配套的陽性圖片做為陽性對照。陽性表達位于細胞核呈黃色或棕褐色顆粒，400倍顯微鏡下計數1 000個細胞，計算陽性細胞百分數作為PI[7]。

1.4 食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中凋亡指數(AI)測算 采用TUNEL法。制片方法同上，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS緩沖液沖洗，滴加不含DNase的蛋白酶K 20 μg/mL，常溫下反應15～30 min，PBS沖洗，制備并滴加TUNEL反應混合液，滴加PBS熒光顯微鏡下計數，滴加converter-POD，反應30 min，PBS沖洗，加入DAB反應，PBS沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性表達位于細胞核呈黃色或棕褐色顆粒，400倍顯微鏡下計數1 000個細胞，計算陽性細胞百分數作為AI[8]。

1.5 隨訪及預后觀察 所有患者通過門診復查或電話隨訪，隨訪時間為36個月，根據食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達的均值將患者分為miR-145高表達組、miR-145低表達組；miR-765高表達組、miR-765低表達組，比較各組生存狀況。

2 結果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中miR-145、miR-765表達比較 食管鱗狀細胞癌與癌旁組織中miR-145相對表達量分別為0.943±0.178、3.598±0.443，miR-765相對表達量分別為3.836±0.502、1.201±0.282，食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中miR-145、miR-765表達比較，P均<0.05。

2.2 食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中PI、AI比較 食管鱗狀細胞癌與癌旁組織中PI分別為(32.07±4.28)%、(16.75±2.75)%，AI分別為(2.88±0.72)%、(13.89±2.37)%，食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中PI、AI比較，P均<0.05。

2.3 食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達與PI 、AI的相關性 Pearson相關分析顯示，食管鱗狀細胞癌組織中miR-145表達與PI呈負相關(r=-0.522，P<0.05)，與AI呈正相關(r=0.578，P<0.05)；miR-765表達與PI呈正相關(r=0.602，P<0.05)，與AI呈負相關(r=-0.511，P<0.05)。

2.4 食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達與患者臨床病理特征的關系 中低分化、TNM分期Ⅲ期患者miR-145表達低于高分化、TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期患者(P均<0.05)，miR-765表達高于高分化、TNM 分期Ⅰ期+Ⅱ期患者(P均<0.05)。不同性別、年齡、腫瘤直徑的食管鱗狀細胞癌患者癌組織中miR-14、miR-765表達比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 食管癌組織中miR-145、miR-765表達與患者臨床病理特征的關系

2.5 食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達與患者預后的關系 80例患者完成36個月隨訪，失訪4例，予以剔除，失訪率5.00%。至隨訪結束存活48例，死亡28例，miR-145高表達組、miR-145低表達組生存率分別為82.35%(28/34)、47.62%(20/42)；miR-765高表達組、miR-765低表達組生存率分別為48.65%(18/37)、76.92%(30/39)；經Log-rank檢驗發現，miR-145高表達組生存率高于miR-145低表達組，miR-765低表達組生存率高于miR-765高表達組(χ2分別為9.742、6.523，P均<0.05)。

2.6 食管鱗狀細胞癌患者死亡的危險因素分析 以食管鱗狀細胞癌患者為樣本，患者是否死亡為因變量，以性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期、miR-145表達、miR-765表達為自變量，建立Cox比例風險回歸分析模型，結果顯示組織中低分化、TNM分期Ⅲ期、miR-145低表達、miR-765高表達是食管鱗狀細胞癌患者死亡的危險因素(P均<0.05)，見表2。

表2 食管鱗狀細胞癌患者死亡危險因素的Cox比例風險回歸分析

3 討論

食管鱗狀細胞癌是食管癌的主要組織類型，該病病因和發病機制復雜，目前仍未完全明確。從臨床治療情況來看，由于食管鱗狀細胞癌早期癥狀體征不明顯，多數患者就診時已處于中晚期，不僅增加了治療難度，還能影響患者預后和生存質量。食管鱗狀細胞癌的發生發展是多步驟、多基因參與的長期過程，涉及到眾多基因的異常表達。miR是一類長度在20個核苷酸左右的內源性非編碼小RNA分子，其數量眾多[9]。研究表明，miR廣泛參與機體生理功能和疾病的發生，尤其是在腫瘤的發生發展中扮演重要角色，在腫瘤的診斷、治療和預后判斷中有一定的應用潛力[10]。

miR-145定位于染色體5q32-33，是一類廣泛存在于機體各類組織的miR[11]。研究表明，miR-145在膀胱癌組織中呈低表達，可作為抑癌基因參與腫瘤的生長、浸潤和轉移等過程[12]。張月寧等[13]報道，miR-145可抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達，進而抑制卵巢癌細胞增殖和遷移，促進其凋亡。邴鐘興等[14]報道，miR-145可在通過體外調節途徑抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖。miR-765定位于染色體1q23.1，具有促進細胞增殖的功能[15]。已有報道顯示，在乳腺癌組織中miR-765呈異常高表達[16]。本研究結果顯示，在食管鱗狀細胞癌組織中存在miR-145異常低表達和miR-765異常高表達，表明miR-145、miR-765與食管鱗狀細胞癌的發生發展密切相關。眾所周知，腫瘤的發生是細胞異常增殖的結果，腫瘤的發生與細胞PI增高和AI降低密切相關。而本研究中食管鱗狀細胞癌組織中miR-145表達與PI呈負相關，與AI呈正相關；miR-765表達與PI呈正相關，與AI呈負相關。提示miR-145、miR-765可以通過調控細胞增殖和凋亡影響食管鱗狀細胞癌的發生發展。

進一步分析發現，miR-145、miR-765表達與食管鱗狀細胞癌組織分化程度、TNM分期有關。這可能是因為miR-145的降低導致MMP-2、MMP-9水平升高，進而增強癌細胞的侵襲能力和轉移能力[13]。miR-145低表達和miR-765高表達還可能增強食管鱗狀細胞的增殖能力，降低其凋亡率，進而影響食管鱗狀細胞癌組織分化程度、TNM分期[17]。

本研究對食管鱗狀細胞癌患者進行了36個月的隨訪，結果顯示miR-145高表達組生存率優于miR-145低表達組，miR-765低表達組生存率優于miR-765高表達組。以往研究證實中低分化、TNM分期Ⅲ期是食管鱗狀細胞癌患者死亡的危險因素[18]，而本研究結果進一步揭示miR-145低表達、miR-765高表達是食管鱗狀細胞癌患者死亡的危險因素，提示miR-145、miR-765可對患者預后判斷提供幫助。

綜上所述，食管鱗狀細胞癌組織中存在miR-145異常低表達，miR-765異常高表達，二者與食管鱗狀細胞癌組織PI、組織分化程度、TNM分期有關，食管鱗狀細胞癌組織中miR-145、miR-765表達與患者生存期有關，miR-145低表達、miR-765高表達是食管鱗狀細胞癌患者死亡的危險因素。