外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者療效判斷和預(yù)后評(píng)估的價(jià)值

辛雪，王麗，杜以萍

青島市第八人民醫(yī)院血液內(nèi)科，山東青島 266042

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是世界范圍內(nèi)最常見的非霍奇金淋巴瘤，占初診非霍奇金淋巴瘤的35%～40%，以高度遺傳異常和不同的臨床特征、治療反應(yīng)、預(yù)后為特點(diǎn)，具有高度異質(zhì)性[1-2]。近年來(lái)，隨著利妥昔單抗聯(lián)合CHOP方案(環(huán)磷酰胺+多柔比星+長(zhǎng)春新堿+潑尼松)的應(yīng)用，60%～70%的DLBCL患者可被治愈，但仍有30%～40%的患者復(fù)發(fā)[3]。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)參與DLBCL發(fā)生發(fā)展[4]。CRNDE是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，可作為原癌基因參與結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-7]。但關(guān)于LncRNA-CRNDE與DLBCL的關(guān)系尚不明確。2014年1月—2021年5月，我們觀察了DLBCL患者外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)變化，并探討其對(duì)DLBCL療效判斷和預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2014年1月—2016年5月收治的179例DLBCL患者為DLBCL組，其中男97例、女82例，年齡24～75(54.25±5.36)歲。27例有B癥狀(包括發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量減輕)，152例無(wú)B癥狀；23例有大包塊，156例無(wú)大包塊；Hans分型[8]：68例生發(fā)中心，111例非生發(fā)中心；Ann Arbor分期[9]：Ⅰ、Ⅱ期78例，Ⅲ、Ⅳ期101例；國(guó)際預(yù)后指數(shù)[10]：0～2分137例，3～5分42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)和免疫組化檢查確診為DLBCL；②年齡≥18歲；③可接受隨訪者；④預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；⑤臨床資料和隨訪資料完整者；⑥患者及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②非初診，復(fù)發(fā)DLBCL者；③入組前接受抗腫瘤治療者；④慢性活動(dòng)性炎癥疾病者；④合并急性感染者；⑤血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病者；⑥心、肝、腎等重要臟器功能損害者。另選取同期64例體檢健康者為對(duì)照組，其中男35例、女29例，年齡18～78(53.17±5.42)歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016-QH-045)。

1.2 治療方法 DLBCL患者確診后接受利妥昔單抗聯(lián)合CHOP方案化療，靜脈滴注利妥昔單抗(上海羅氏制藥有限公司，注冊(cè)證號(hào)：S20120003，規(guī)格：100 mg/10 mL)，365 mg/m2，第1天；靜脈滴注環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H32024654，規(guī)格：1 g)，750 mg/m2，第2天；靜脈滴注長(zhǎng)春新堿(廣東嶺南制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20065857，規(guī)格：1 mg/支)，1.4 mg/m2，第2天；靜脈滴注多柔比星(意大利法瑪西亞公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20030674，規(guī)格：50 mg/支)，50 mg/m2，第2天；口服潑尼松(浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H33021207，規(guī)格：5 mg/片)，每天每次100 mg，第2～6天。21 d為1個(gè)化療周期，治療4～6個(gè)周期。

1.3 外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)測(cè)定 采集DLBCL組入院時(shí)和化療4個(gè)周期后及對(duì)照組體檢時(shí)2 mL外周血，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取上層血漿置于EP管中，放入-80 ℃冰箱中待檢。TRIzol試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司；貨號(hào)：RN0401)提取血清總RNA，NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)驗(yàn)證RNA濃度和純度，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海易匯生物科技有限公司；貨號(hào)：206143)合成cDNA，qRT-PCR試劑盒(廣州斯佳生物科技有限公司，貨號(hào)：BL705A)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。LncRNA-CRNDE正向引物：5′-ACACGGCTTTCCGGAGTA-3′，反向引物：5′-GCCAACATTTGGAGGAACCC-3′；內(nèi)參β-actin正向引物：5′-CCTTACGCCAACACAGTGC-3′，反向引物：5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。反應(yīng)體系：1 μL cDNA、0.3 μL引物、5 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Mix、3.4 μL ddH2O；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán)40次。2-ΔΔCt法計(jì)算外周血LncRNA-CRNDE相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) ①療效。療程結(jié)束后，參考《中國(guó)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)》[11]中療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。完全緩解：所有的病灶證據(jù)均消失；部分緩解：可測(cè)量病灶縮小，無(wú)新病灶出現(xiàn)；疾病穩(wěn)定：未達(dá)完全緩解、部分緩解或疾病進(jìn)展；復(fù)發(fā)或疾病進(jìn)展：任何新增加的病灶或原病灶，直徑增大≥50%。②5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率。患者出院后均通過門診或電話方式進(jìn)行隨訪5年，隨訪截至2021年5月，統(tǒng)計(jì)5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率。無(wú)進(jìn)展生存率定義為接受治療開始至疾病進(jìn)展或隨訪截止、死亡；總生存率定義為化療至隨訪截止或死亡。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)比較 DLBCL組和對(duì)照組外周血LncRNA-CRNDE相對(duì)表達(dá)量分別為3.133±0.954、1.798±0.758，DLBCL組外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)高于對(duì)照組(t=10.108，P<0.01)。

2.2 DLBCL患者治療前后外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)比較 DLBCL患者治療前后外周血LncRNA-CRNDE相對(duì)表達(dá)量分別為3.133±0.954、2.004±0.830，治療后外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)低于治療前(t=11.860，P<0.01)。

2.3 不同療效DLBCL患者外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)比較 DLBCL患者治療4～6個(gè)周期后，完全緩解84例，部分緩解48例，疾病穩(wěn)定32例，復(fù)發(fā)或疾病進(jìn)展15例，將完全和部分緩解患者132例納為有效組，疾病穩(wěn)定和復(fù)發(fā)或疾病進(jìn)展患者47例納為無(wú)效組。有效組治療前后外周血LncRNA-CRNDE相對(duì)表達(dá)量分別為3.023±0.756、1.863±0.668，無(wú)效組分別為3.441±1.326、2.399±1.086，有效組治療前后外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)低于無(wú)效組(P<0.05)。

2.4 外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系 外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)與DLBCL患者Ann Arbor分期和國(guó)際預(yù)后指數(shù)相關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、B癥狀、大包塊、Hans分型無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪5年，DLBCL患者5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率分別為67.60%(121/179)、82.68%(148/179)。根據(jù)外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)均值分為兩組，LncRNA-CRNDE表達(dá)≥3.133組(n=89)5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率分別為61.80%(55/89)、76.40%(68/89)，LncRNA-CRNDE<3.133組(n=90)5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率分別為73.33%(66/90)、88.89%(80/90)。K-M曲線顯示，LncRNA-CRNDE表達(dá)≥3.133組5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率低于LncRNA-CRNDE<3.133組(Log-rankχ2分別為4.808、5.752，P均<0.05)。

2.6 DLBCL患者預(yù)后不良影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析 以單因素分析有差異指標(biāo)為自變量，隨訪時(shí)間為時(shí)間變量，是否存活(死亡=1，存活=0)為因變量，多因素Cox回歸分析顯示，Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、國(guó)際預(yù)后指數(shù)3～5分、LncRNA-CRNDE≥3.133為DLBCL患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P均<0.05)。見表2、3。

表2 DLBCL患者預(yù)后不良影響因素的單因素分析[例(%)]

2.7 外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)對(duì)DLBCL患者預(yù)后不良的評(píng)估價(jià)值 繪制的ROC曲線顯示，外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)評(píng)估DLBCL患者預(yù)后不良的曲線下面積、最大約登指數(shù)、最佳截?cái)嘀怠㈧`敏度、特異度為0.815(95%CI：0.771～0.854)、0.469、3.460、80.45%、66.48%。

表3 DLBCL患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

DLBCL是一種以大B淋巴細(xì)胞呈彌漫性生長(zhǎng)為特征的高度侵襲性淋巴樣惡性腫瘤，盡管利妥昔單抗的出現(xiàn)提升了CHOP方案的化療效果，但臨床標(biāo)準(zhǔn)化治療的效果仍存在差異，部分患者存在難治或完全緩解后復(fù)發(fā)，此類患者僅有10%的治愈可能[12]。因此對(duì)初診DLBCL進(jìn)行危險(xiǎn)分層和選擇個(gè)體化治療方案尤其重要，目前臨床普遍使用國(guó)際預(yù)后指數(shù)評(píng)估DLBCL患者預(yù)后，但仍存在一定局限性。

近年來(lái)，非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)為腫瘤研究提供了新的方向，下一代測(cè)序和生物信息學(xué)方法的快速發(fā)展揭示了非編碼RNA與癌癥生物學(xué)存在密切聯(lián)系[13]。LncRNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA能在多個(gè)水平上調(diào)控基因表達(dá)，從而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。目前研究證實(shí)，LncRNA作為關(guān)鍵調(diào)控因子，參與多種腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程[14]。LncRNA-CRNDE定位于人染色體16q12.2，最早GRAHAM等[15]在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)LncRNA-CRNDE呈高表達(dá)，因此命名為L(zhǎng)ncRNA-CRNDE。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-CRNDE還參與其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-17]。BAI等[16]研究顯示，LncRNA-CRNDE通過海綿微小RNA-183調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素B1表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。ZHU等[17]研究顯示，LncRNA-CRNDE通過調(diào)節(jié)微小RNA-451a/調(diào)節(jié)周期素依賴性激酶抑制因子2D軸促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展和血管生成。本研究結(jié)果顯示，DLBCL組外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)高于對(duì)照組，并與Ann Arbor分期和國(guó)際預(yù)后指數(shù)相關(guān)，提示LncRNA-CRNDE可能作為一種癌基因參與DLBCL發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，DLBCL患者化療后外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)降低，說明外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)可能成為療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果還顯示，治療前和化療后有效組外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)均低于無(wú)效組，進(jìn)一步說明監(jiān)測(cè)患者化療期間外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)可判斷患者療效。此外，有效組治療前后差異較無(wú)效組更大，提示LncRNA-CRNDE高表達(dá)可能影響化療療效。KANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制LncRNA-CRNDE能通過Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑抑制急性髓細(xì)胞白血病多藥耐藥。近期楊向綢等[19]研究顯示，LncRNA-CRNDE高表達(dá)與DLBCL患者化療不敏感有關(guān)。目前多項(xiàng)研究表明，LncRNA-CRNDE高表達(dá)與惡性腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)，如腎細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌[20-21]。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-CRNDE表達(dá)≥3.133組5年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率降低，提示外周血LncRNA-CRNDE高表達(dá)可能反映患者預(yù)后更差，進(jìn)一步通過Cox回歸分析證實(shí)，LncRNA-CRNDE表達(dá)≥3.133是DLBCL患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。ROC曲線結(jié)果顯示，LncRNA-CRNDE可作為DLBCL患者預(yù)后不良評(píng)估指標(biāo)。LncRNA-CRNDE作為一種潛在新型的腫瘤標(biāo)志物，目前已有研究證實(shí)其能通過影響細(xì)胞代謝、腫瘤信號(hào)通路、細(xì)胞內(nèi)重要蛋白表達(dá)、染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控等方式參與相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于其與LncRNA-CRNDE的調(diào)控關(guān)系尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過分析DLBCL患者初診時(shí)和化療后外周血LncRNA-CRNDE表達(dá)發(fā)現(xiàn)，LncRNA-CRNDE可能成為判斷DLBCL療效的生物標(biāo)志物，并證實(shí)外周血LncRNA-CRNDE高表達(dá)是DLBCL患者化療后預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，可能成為一種新型的靶點(diǎn)。

綜上所述，DLBCL患者外周血LncRNA-CRNDE高表達(dá)，LncRNA-CRNDE高表達(dá)與DLBCL患者療效較差和預(yù)后不良相關(guān)，可作為預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。但本研究為初步研究，樣本量較少，未從分子方向研究LncRNA-CRNDE表達(dá)對(duì)DLBCL的影響，其具體調(diào)控關(guān)系還需進(jìn)一步研究。