動脈瘤性蛛網膜下腔出血后遲發性腦缺血患者血清miR-210、sLOX-1水平變化及意義

趙永，楊建波，林琳

1新疆醫科大學附屬中醫醫院神經外科，烏魯木齊830000；2新疆醫科大學附屬中醫醫院神經內科

蛛網膜下腔出血是指腦表面或腦底部血管破裂后，血液進入蛛網膜下腔而引起的相應臨床癥狀，占所有腦卒中5%～10%[1]。顱內動脈瘤是指腦動脈內腔局限性異常擴大引起動脈壁上的異常膨出，為蛛網膜下腔出血最常見病因，占比約85%，具有起病急、致殘率高、病死率高等特點[2]。遲發性腦缺血(DCI)為動脈瘤性蛛網膜下腔出血(aSAH)患者嚴重神經功能缺損和死亡的重要原因，其發生不僅涉及腦血管痙攣(CVS)，還涉及炎癥反應[3]。微小RNA(miRNA)-210為miRNA重要成員，能通過Toll樣受體(TLR)/核因子-κB(NF-κB)信號通路調控炎性因子表達[4]。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)是一種黏附因子，可通過結合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)增加細胞內活性氧，降低一氧化氮利用率，啟動血管擴張抑制[5]。LIN等[6]研究報道，兔aSAH后基底動脈壁上LOX-1和ox-LDL表達上調。因此我們推測LOX-1可能參與aSAH后DCI發生。可溶性凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(sLOX-1)由LOX-1細胞外結構域的蛋白水解性裂解產生，能反映LOX-1表達情況。2016年1月—2020年12月,我們探討了aSAH后DCI患者血清miR-210、sLOX-1水平變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2020年12月收治的137例aSAH患者，其中男54例、女83例，年齡32～86(56.07±11.22)歲；體質量指數18～29(24.08±2.19)kg/m2；責任動脈瘤部位：前循環111例，后循環26例；Hunt-Hess分級[7]：Ⅰ級37例，Ⅱ級50例，Ⅲ級30例，Ⅳ級17例。納入標準：①經CT血管成像確診，符合文獻[7]診斷標準；②初次發病，且為單發顱內責任動脈瘤；③Hunt-Hess分級Ⅰ～Ⅳ級；④發病至入院治療時間<72 h；⑤年齡≥18歲；⑥臨床資料完整者；⑦患者及家屬均知情研究；排除標準：①既往aSAH病史或未破裂顱內動脈瘤治療史者；②血液疾病、顱內感染、腫瘤性卒中繼發的aSAH；③腦實質出血破入蛛網膜下腔或外傷性aSAH者；④入院72 h內死亡或放棄治療者；⑤深度昏迷，無自主呼吸者；⑥入院前合并嚴重感染者；⑦合并心、肝、腎等臟器功能損害者；⑧妊娠及哺乳期婦女。本研究經倫理委員會批準(2018-12-023)。

1.2 基礎資料收集 收集患者基礎資料，包括性別、年齡、體質量指數[體質量(kg)/身高(m)2]、吸煙史(≥1支/d，連續吸煙≥6個月)、飲酒史(≥40 g/d，≥1次/周，持續≥6個月)、病史(糖尿病、高血壓、冠心病、高血脂癥等)、責任動脈瘤部位、動脈瘤直徑、Hunt-Hess分級、治療方式(保守治療、開顱夾閉、血管內治療、開顱夾閉+血管內治療)。

1.3 血清miR-210、sLOX-1水平測定 采集患者入重癥監護室時6 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，取上清，分為兩份，置于-80 ℃冰箱中待檢。其中一份采用TRIzol法提取血清總RNA(試劑購自北京普利萊基因技術有限公司；貨號：R1030)，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，Qiagen反轉錄試劑盒(上海玉博生物科技有限公司；貨號：Qiagen 205111)轉錄合成cDNA，加入miR-210引物(正向引物：5′-CGTAGCTGTAGTCGTAGCTG-3′；反向引物：5′-GATGCTGATCGATCGTGTcG-3′)，以U6做內參(正向引物：5′-ACGTGATGCCGTGACGATCT-3′；反向引物：5′-CGATGTCGAGCTAGTGCTAC-3′)，PCR擴增條件：95 ℃10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，循環40次，反應結束后得到各管Ct，2-ΔΔCt法計算miR-140-3p相對表達量。另一份用酶聯免疫吸附法測血清sLOX-1水平，試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號：ARB10414)。

1.4 DCI診斷和分組 DCI定義為出現局灶性神經功能缺損(如偏態、失語、偏盲等)，持續時間>1 h，或格拉斯哥預后量表(GOS)[8]惡化≥2分。且排除代謝紊亂、發燒、癲癇、腦積水、腦水腫、藥物效應等其他原因導致的神經功能缺損[9]。根據是否發生DCI分為DCI組(n=33)和非DCI組(n=104)。

2 結果

2.1 兩組基礎資料比較 DCI組高血壓比例、高血脂癥比例、收縮壓、Hunt-Hess分級高于非DCI組(P均<0.05)。其他指標組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 兩組基礎資料比較

2.2 兩組血清miR-210、sLOX-1水平比較 DCI組、非DCI組血清miR-210水平分別為0.63(0.55,0.68)、0.82(0.69,1.01)，sLOX-1水平分別為1 550.71(1 425.37,1 677.24)、1 123.07(837.57,1 399.36)pg/mL，兩組比較，差異均有統計學意義(Z分別為-5.443、-5.879，P均<0.001)。

2.3 aSAH后DCI影響因素的多元Logistic回歸分析 以高血壓、高血脂癥、收縮壓、Hunt-Hess分級(≥Ⅲ級=1，<Ⅲ級=0)、miR-210、sLOX-1為自變量，是否發生DCI為因變量(不良=1，良好=0)，多元Logistic回歸分析顯示，Hunt-Hess分級≥Ⅲ級、高sLOX-1水平為aSAH后DCI獨立危險因素，高miR-210水平為獨立保護因素(P<0.05)。見表2。

表2 aSAH后DCI影響因素的多元Logistic回歸分析

2.4 血清miR-210、sLOX-1水平預測aSAH后DCI的價值 ROC曲線顯示，血清miR-210、sLOX-1水平預測aSAH后DCI的AUC、截斷值、靈敏度、特異度為0.815(95%CI：0.740～0.876)、0.70、87.88%、71.15%和0.840(95%CI：0.768～0.897)、1362.70 pg/mL、87.88%、74.04%，miR-210+sLOX-1預測aSAH后DCI的AUC為0.910(95%CI：0.849～0.952)，大于miR-210、sLOX-1水平單獨預測(Z分別為3.616、2.573，P均<0.05)，靈敏度、特異度為100.00%、76.92%。

3 討論

aSAH是一種嚴重威脅人類生命健康的腦血管疾病，DCI為aSAH主要并發癥，研究表明，超過30%的aSAH患者在動脈瘤破裂后3～14 d發生DCI，雖然隨著診斷模式、醫療條件、顯微外科技術的快速發展，aSAH患者預后明顯改善，但DCI仍是aSAH致殘、致死的重要原因，即使全力搶救，仍有50%的患者因此死亡，其余多數存活患者存留嚴重神經功能損害，生活不能自理[7]。因此早期預測aSAH后DCI有助于改善aSAH患者醫療資源配置和優化護理，改善預后。顱內動脈瘤破裂后，大量血液進入蛛網膜下腔，紅細胞裂解為血紅素、血紅蛋白等物質于出血部位沉積觸發炎癥級聯反應，進一步損傷血管平滑肌細胞和內皮細胞，誘發CVS，減少腦血流量，導致DCI[3]。

miRNAs是一類由19～24個核苷酸組成的內源性單鏈非蛋白質編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區的堿基互補結合，使靶基因mRNA翻譯抑制和降解，參與調節細胞生長、增殖、遷移、凋亡等多種重要細胞生物進程[10]。miR-210位于人染色體11p15.5，是一種重要缺氧誘導基因，參與抑制細胞增殖、DNA損傷修復和促進血管生成等細胞功能，近年研究發現，miR-210還具有炎癥調節作用[11]。腫瘤壞死因子-α是一種涉及系統性炎癥的細胞因子，可激活內皮細胞、巨噬細胞釋放細胞間黏附分子-1，調節受損區域組織中性粒細胞黏附，啟動CVS，也可通過上調Ⅰ型膠原蛋白表達，增加血管壁張力，導致痙攣血管腔持續狹窄[12]。ZACCAGNINI等[13]使用脂多糖誘導巨噬細胞炎癥反應發現，miR-210能抑制巨噬細胞腫瘤壞死因子-α等促炎因子產生，因此我們推測miR-210可能與aSAH后DCI有關。本研究結果顯示，DCI組血清miR-210水平低于非DCI組，為aSAH后DCI獨立保護因素，說明低表達miR-210與aSAH后DCI發生有關。TLR4是模式識別受體家族成員，在大腦內廣泛表達。研究表明，顱內動脈瘤破裂后，神經細胞表面TLR4在紅細胞裂解物刺激下能激活NF-κB通路(炎癥反應重要信號通路)，增加腫瘤壞死因子-α、細胞間黏附分子-1等促炎因子表達，加劇aSAH大鼠腦血管和神經損傷，單核細胞內TLR4表達與DCI獨立相關[14]。ZACCAGNINI等[13]發現，轉染miR-210能通過TLR4/NF-κB通路抑制巨噬細胞炎癥反應。MA等[14]建立aSAH后CVS大鼠模型發現，枕大池注射miR-20能減少基底動脈壁厚度，增加基底動脈管直徑，預防aSAH后CVS發生，蛋白質印跡法檢測也發現大鼠基底動脈腫瘤壞死因子-α和TLR4表達顯著下調。基于以上研究，我們認為miR-210可能通過TLR4/NF-κB通路抑制炎癥反應，發揮aSAH后DCI保護作用。

LOX-1為血管內皮細胞攝取ox-LDL主要受體，參與ox-LDL結合、內吞、蛋白降解等過程，在炎癥反應、缺血缺氧、高血糖水平等狀態下大量分泌。ox-LDL是動脈硬化發生和發展過程中重要參與者，LOX-1可通過結合ox-LDL，促進泡沫細胞形成，增強泡沫細胞吞噬脂質能力，并能結合其相應配體，加重局部炎性刺激，損傷內皮細胞功能，促進動脈硬化形成[15]。目前大多研究均關注LOX-1與動脈硬化的關系，用以診斷急性缺血性卒中、急性腦出血、缺血性心臟病等[16]。LOX-1參與血管擴張抑制[5]，在aSAH后基底動脈壁大量表達[6]，且與多種缺血性疾病相關，因此我們猜測LOX-1可能與aSAH患者腦血管功能障礙有關。本研究結果顯示，DCI組血清sLOX-1水平低于非DCI組，分析是DCI組病情嚴重，炎癥反應刺激內皮細胞大量表達LOX-1有關。進一步分析顯示，高血清sLOX-1水平為aSAH后DCI獨立危險因素，說明高表達sLOX-1與aSAH后DCI發生有關。目前尚不明確LOX-1參與aSAH后DCI的相關機制，但DCI主要因動脈內皮功能失調和平滑肌收縮引起CVS導致[6]，而LOX-1參與內皮細胞功能損傷。LI等[17]研究發現，抑制LOX-1表達可抑制活性氧/NF-κB信號通路，減輕動脈硬化小鼠炎癥反應。近期研究報道，高血清sLOX-1水平與aSAH患者預后不良相關[18]。基于以上研究，我們推測LOX-1可能通過損傷內皮功能和促炎反應參與DCI發生。ROC曲線顯示，血清miR-210、sLOX-1水平均對aSAH后DCI有一定預測價值，二者聯合AUC增加，說明聯合檢測能提高aSAH后DCI預測價值。

綜上所述，aSAH后DCI患者血清miR-210水平降低，sLOX-1水平升高，為aSAH后DCI發生獨立影響因素，聯合檢測能提高aSAH后DCI預測價值。但aSAH后DCI影響因素較多，本研究并未全部納入分析，可能存在選擇偏倚；同時關于miR-210、sLOX-1與aSAH后DCI的關系尚不明確，缺乏相關機制研究，還需多中心、大樣本研究證實。