唑來膦酸聯(lián)合二甲雙胍對(duì)db/db小鼠骨質(zhì)的影響

趙文，楊興堯，林炎水

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，成都610500

糖尿病和骨質(zhì)疏松癥作為兩種常見的慢性疾病，其發(fā)病率隨著社會(huì)老齡化的加劇逐年上升。糖尿病患者出現(xiàn)骨量降低、骨骼脆性增加、骨骼微結(jié)構(gòu)受損等病理改變，稱之為糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(DO)[1]。DO可明顯增高患者脆性骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，引發(fā)長期嚴(yán)重疼痛和運(yùn)動(dòng)功能障礙，提高患者致殘率和致死率[2]。唑來膦酸現(xiàn)為絕經(jīng)后女性抗骨質(zhì)疏松治療的常規(guī)用藥，有相關(guān)研究已證明其可防止糖尿病動(dòng)物的骨丟失和增加動(dòng)物骨密度[3]。二甲雙胍類藥物為2型糖尿病患者一線口服用藥，諸多學(xué)者對(duì)其是否具有抗骨質(zhì)疏松效果進(jìn)行了試驗(yàn)及臨床調(diào)查研究。JOSEPH等[4]對(duì)23 000余例患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，服用二甲雙胍的糖尿病患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)小于未服用二甲雙胍的糖尿病患者。LU等[5]對(duì)臺(tái)灣30 000余例糖尿病患者進(jìn)行長達(dá)15年的隨訪，發(fā)現(xiàn)接受二甲雙胍治療的DO患者骨質(zhì)疏松率低于未接受二甲雙胍治療者。有研究報(bào)道，二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK而在體外成骨，從而促進(jìn)成骨分化、骨基質(zhì)合成和成骨細(xì)胞增殖[6]。JEYABALAN等[7]對(duì)雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行卵巢切除(OVX)后，給予二甲雙胍干預(yù)，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)骨量無明顯變化；對(duì)股骨骨缺損的雌性Wistar大鼠給予二甲雙胍，發(fā)現(xiàn)其對(duì)骨折愈合無明顯影響。故而二甲雙胍對(duì)骨質(zhì)的影響目前尚無明確結(jié)論。對(duì)于DO患者，唑來膦酸注射液可在不影響患者的體質(zhì)量、血糖前提下改善患者骨質(zhì)條件[8-9]。2019年6月—2020年6月，我們探討了唑來膦酸聯(lián)合二甲雙胍聯(lián)合使用對(duì)骨質(zhì)新陳代謝的影響，為DO患者選擇藥物治療提供參考，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇SPF級(jí)12周雄性BKS-Leprem2Cd479/Gpt品系db/db小鼠23只，平均體質(zhì)量42 g，基因型為(Lepr)ko/ko，以及同品系的基因型為(Lepr)wt/wt的小鼠6只，平均體質(zhì)量22 g，動(dòng)物均購于中國江蘇集萃藥康生物科技有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)1996年修訂的美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南(NIH出版物第80-23號(hào))進(jìn)行。藥物及儀器：唑來膦酸注射液(密固達(dá))購自成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科(Novartis pharm Stein AG schaffhauserstrasse 4332 Stein 瑞士，批號(hào)：SRH49)。鹽酸二甲雙胍緩釋片(倍順)購自成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科(成都恒瑞制藥有限公司，批號(hào)：190721)。(ONETOUTH UltraVue)血糖儀、血糖試紙購于強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器材有限公司；Micro-ct(型號(hào)：ZKKS-MCT-Sharp)。Thermo 組織脫水機(jī) AS(英國賽默飛世爾公司)，Thermo組織切片機(jī)(英國賽默飛世爾公司)，Dako CoverStainer全自動(dòng)HE染色機(jī)(丹麥Dako公司)，蘇木精及伊紅染料(丹麥Dako公司)。

1.2 動(dòng)物喂養(yǎng)及給藥方式 將6只wt/wt小鼠(正常小鼠，未患糖尿病)納入WT組。再根據(jù)用藥方案的不同，將23只db/db小鼠按隨機(jī)表法分為四組：5只納入DB/DB組、6只納入唑來膦酸組(ZA組)、6只納入二甲雙胍組(MET組)、6只納入聯(lián)合用藥組(CMT組)。在喂養(yǎng)期間，所有實(shí)驗(yàn)小鼠獲得足夠的純凈水和食物，于成都醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)小鼠。室溫為20～25 ℃，明暗交替照射12 h/12 h。WT組和DB/DB組每天給予等量生理鹽水腹腔注射。ZA組僅第1次腹腔注射唑來膦酸注射液100 μg/kg[10]，之后每日給予MET組等量生理鹽水腹腔注射。MET組每日給予200 mg/kg二甲雙胍溶液腹腔注射[11]。CMT組僅第1次腹腔注射唑來膦酸100 μg/kg，之后每日腹腔注射二甲雙胍200 mg/kg。四組小鼠分別干預(yù)5周。

1.3 小鼠體質(zhì)量、血糖測定 常規(guī)飼料喂養(yǎng)5組小鼠，每2周測量小鼠體質(zhì)量和血糖，每次測量時(shí)小鼠禁食8 h，然后經(jīng)小鼠尾靜脈采血，小鼠血糖值由血糖儀測定并顯示。若小鼠血糖值高于血糖儀檢測最大值，則記錄為33.3 mmol/L。

1.4 各組小鼠脛骨平臺(tái)切片觀察 采用HE染色法。取對(duì)側(cè)脛骨行病理檢查，通過4%多聚甲醛中固定48 h，再經(jīng)過脫鈣、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，切片厚度為5 μm。在普通光學(xué)顯微鏡下放大50倍后觀察并拍照。

1.5 骨保護(hù)素(OPG)表達(dá)測定 采用免疫組化染色法。使用OPG一抗(美國Abcam公司)在已經(jīng)完成切片的脛骨組織上染色，正置熒光顯微鏡下觀察骨組織切片免疫組化染色結(jié)果。隨機(jī)選擇5個(gè)鏡下視野拍照并保存。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行半定量分析。OPG染色陽性結(jié)果為胞漿呈棕黑色或者褐色，胞核為藍(lán)色。

1.6 骨陷窩數(shù)量測算 采用臺(tái)盼藍(lán)—伊紅(TE)染色。使用臺(tái)盼藍(lán)染色試劑(中國索萊寶公司)和伊紅染色試劑(中國索萊寶公司)對(duì)脛骨組織切片染色，正置熒光顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)，觀察區(qū)域?yàn)槊劰瞧脚_(tái)近端骨質(zhì)，400倍光鏡下觀察染色后的組織形態(tài)、骨細(xì)胞、骨陷窩及破骨細(xì)胞，對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，鏡下拍照并記錄骨陷窩數(shù)量，半定量分析骨陷窩數(shù)量。

1.7 小鼠脛骨影像學(xué)檢查 將小鼠脛骨附著組織剔除干凈,放入Micro-CT(型號(hào)：ZKKS-MCT-Sharp)對(duì)脛骨進(jìn)行 X 射線掃描。數(shù)據(jù)處理軟件：ZZKS-MicroCT4.1。將實(shí)驗(yàn)樣本沿長軸固定于固定器內(nèi)，能量/強(qiáng)度為70 kVP，100 μA 7 W，4幀疊加曝光時(shí)間100 ms，掃描時(shí)間為12 min。掃描完成后，選取距生長板遠(yuǎn)端0.7 mm、層厚1.5 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域(ROI)進(jìn)行三維重建，以最低閾值為66提取圖像信息。使用其軟件(SCANCO Medical AG)進(jìn)行重建定量分析。參數(shù)如下: 連接密度(Conn．D),結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI) ,骨密度(BMD),骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV) ,骨小梁數(shù)量(tTb.N),骨小梁厚度(Tb.Th) ,骨小梁分離度(Tb．Sp)。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量、血糖水平比較 WT組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，血糖保持穩(wěn)定。DB/DB組和ZA組雖然體質(zhì)量變化趨勢與WT組一致，呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢，但DB/DB組和ZA組血糖仍維持在較高水平。MET組和CMT組小鼠體質(zhì)量略有下降，血糖明顯下降。見表1。

表1 五組小鼠體質(zhì)量及血糖水平比較

2.2 各組小鼠脛骨平臺(tái)切片觀察結(jié)果 WT組骨小梁較多，骨髓腔內(nèi)血細(xì)胞較多；而DB/DB組骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞較多，骨小梁較少，骨小梁稀疏細(xì)小，伴有骨折；ZA組骨小梁斷裂，數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)紊亂，間隙擴(kuò)大，包括大量脂肪細(xì)胞；MET組和CMT組骨小梁較多，骨髓腔內(nèi)血細(xì)胞較多，脂肪細(xì)胞較少。

2.3 各組OPG表達(dá)比較 WT組、DB/DB組、ZA組、MET組、CMT組OPG陽性面積分別為80.02±10.53、22.35±4.57、28.22±28.22、40.14±7.08、45.09±8.70。WT組OPG表達(dá)最高，DB/DB組OPG表達(dá)最低，CMT組OPG表達(dá)優(yōu)于DB/DB組、ZA組和MET組，且次于WT組。使用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算染色結(jié)果陽性面積，且對(duì)組間差距行半定量分析。結(jié)果顯示，WT組與DB/DB組、ZA組、MET組和CMT組相比，P均<0.05；DB/DB組與MET組、CMT組相比，P<0.05；DB/DB組與ZA組相比，P>0.05；ZA組與MET組相比，P>0.05；ZA組與CMT組相比，P<0.05；MET組與CMT組相比，P>0.05。

2.4 各組TE染色后骨陷窩計(jì)數(shù)比較 各組小鼠骨組織經(jīng)TE染色后可見骨小梁上骨陷窩存在，部分為空骨陷窩。骨質(zhì)表面可見少量破骨細(xì)胞，形態(tài)不一，成多核狀。WT組、DB/DB組、ZA組、MET組、CMT組骨陷窩計(jì)數(shù)分別為(14.17±6.71)、(33.60±11.44)、(24.17±10.36)、(30.33±9.33)、(23.50±9.73)個(gè)，WT組和DB/DB組相比，P<0.05；WT組與MET組相比，P<0.05。WT組骨陷窩數(shù)量最少，ZA組和CMT組骨陷窩數(shù)量較DB/DB組減少，但MET組減少并不明顯。

2.5 各組BV/TV、Conn.D、SMI、BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比較 見表2。對(duì)樣本行2D成像后，能觀察到WT組的小鼠擁有較多的骨小梁，但DB/DB小鼠脛骨近端伴有大量缺損、空洞，骨小梁明顯減少，骨髓腔變空。ZA組、MET組、CMT組能觀察到骨小梁數(shù)量明顯增多。SEG圖中我們對(duì)ROI骨小梁進(jìn)行成像，能看到WT組骨小梁最多，且集中、有序；DB/DB組小鼠骨小梁最少，并且細(xì)小、分散。

表2 各組Micro-ct掃描結(jié)果比較

3 討論

db/db小鼠具有和2型糖尿病患者極為相似的癥狀，且在其出生4周后就出現(xiàn)高血糖、高血脂等生理表現(xiàn)，目前廣泛運(yùn)用于2型糖尿病的動(dòng)物研究[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠繼發(fā)出現(xiàn)骨量降低、骨鈣素水平降低、骨皮質(zhì)強(qiáng)度降低[13]，故此將db/db小鼠作為2型糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型。因絕經(jīng)后的女性發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的幾率大幅度提高[14]，所以我們選擇雄性的db/db小鼠進(jìn)行試驗(yàn)以此排除性激素的變化對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響，單純觀察藥物對(duì)骨質(zhì)的作用。

對(duì)于二甲雙胍抗骨質(zhì)疏松的作用，國內(nèi)外眾多學(xué)者進(jìn)行了臨床和多種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，至今爭論不一。在動(dòng)物模型水平的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可防止去卵巢(OVX)大鼠的骨丟失[15]，增加骨小梁的數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞的生長[16]。在分子水平方面，二甲雙胍能促進(jìn)成骨過程相關(guān)基因的表達(dá)，如RUNX2和ALP；抑制成脂過程相關(guān)基因表達(dá)，如PPARγ和C/EBPα等[15]；抑制核因子κB配體(RANKL)誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞中的破骨細(xì)胞分化[17]。這些結(jié)果的差異可能是因?yàn)椴煌芯恐杏盟巹┝亢统掷m(xù)時(shí)間的不同、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的差異。由于眾多體外實(shí)驗(yàn)均提示二甲雙胍對(duì)于抗骨質(zhì)疏松治療有積極作用，故我們推測唑來膦酸聯(lián)合二甲雙胍能起到更好的抗骨質(zhì)疏松治療效果。

二甲雙胍的降糖作用現(xiàn)已得到醫(yī)學(xué)界共同認(rèn)可。本次實(shí)驗(yàn)中db/db小鼠脛骨的HE染色切片和TE染色切片中很少發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，這可能是由于高糖高滲的環(huán)境不利于其生長[18-19]。另外，糖尿病患者因長期血糖升高，導(dǎo)致微小血管出現(xiàn)一系列的不良轉(zhuǎn)變，即我們所熟識(shí)的糖尿病主要并發(fā)癥之一。血管作為骨組織的營養(yǎng)物質(zhì)輸送者，其損傷很可能對(duì)骨量、骨結(jié)構(gòu)有所影響[20]。本研究中加用二甲雙胍后經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)，骨組織髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯減少，鏡下觀察到血管增多，且伴有造血細(xì)胞增多，其中血管的增多我們認(rèn)為可能與二甲雙胍可在一定程度上通過減輕炎癥反應(yīng)[21]保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞來修復(fù)血管[22]有關(guān)。我們還觀察到骨髓腔內(nèi)血細(xì)胞的增多，這可能是因?yàn)檠艿脑龆嗪蟮倪B帶作用，也可能是二甲雙胍本身就擁有促進(jìn)血細(xì)胞增殖的功能，這還需要進(jìn)一步的探究。另一方面，即使加用二甲雙胍后，HE染色下的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞依舊很少。雖有體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道二甲雙胍能夠促進(jìn)骨向分化BMSCs的增殖和分化，抑制脂向分化BMSCs的分化，也能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與礦化[17]，但就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，還不足以抑制高糖高滲環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞的負(fù)面影響。

我們對(duì)所有小鼠脛骨樣本進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)只使用唑來膦酸的db/db小鼠骨髓腔內(nèi)有大量脂肪細(xì)胞，骨小梁數(shù)量較未使用藥物的db/db小鼠稍多。只使用二甲雙胍的db/db小鼠骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞明顯減少，造血細(xì)胞增多，骨小梁數(shù)量較未使用藥物的小鼠稍多。而聯(lián)合使用兩種藥物的db/db小鼠，骨髓腔內(nèi)所呈現(xiàn)的結(jié)果包含了兩種藥物單獨(dú)的優(yōu)點(diǎn)，骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞減少，骨小梁數(shù)量增多。進(jìn)行成骨細(xì)胞OPG免疫組化染色后，聯(lián)合用藥組的小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)水平也是高于單獨(dú)使用兩種藥物的db/db小鼠。在隨后的TE染色中，我們采用半定量分析的方法，計(jì)算各組小鼠脛骨骨質(zhì)骨陷窩數(shù)量，發(fā)現(xiàn)了出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松的db/db小鼠擁有更多的骨陷窩，并且伴有部分空骨陷窩。單獨(dú)使用唑來膦酸的db/db小鼠的骨陷窩數(shù)量與聯(lián)合用藥組相當(dāng)，但是單獨(dú)使用二甲雙胍的db/db小鼠的骨陷窩數(shù)量并無顯著減少。經(jīng)Micro-ct掃描得到的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)使用唑來膦酸后的db/db小鼠的骨質(zhì)優(yōu)于未使用的小鼠。加用二甲雙胍后，db/db小鼠在骨小梁數(shù)量、SMI出現(xiàn)優(yōu)勢，在一定程度上說明加用二甲雙胍后，抗骨量丟失以及抗骨質(zhì)疏松優(yōu)于單用唑來膦酸。出現(xiàn)這種結(jié)果我們考慮可能是由于二甲雙胍抑制了脂肪細(xì)胞的增殖、促進(jìn)血管的修復(fù)，改善骨質(zhì)血供進(jìn)而改善骨質(zhì)。但本次實(shí)驗(yàn)因樣本量小，其他骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)差異不明顯，存在一定統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚。

綜上所述，唑來膦酸聯(lián)合二甲雙胍能在一定程度上能降低db/db小鼠的骨量丟失，并優(yōu)于單獨(dú)使用唑來膦酸或二甲雙胍來抗骨質(zhì)疏松治療。