β-欖香烯調控miR-130b-5p/NF-κB信號通路對心肌細胞缺氧復氧損傷的影響及機制

鄧瑞，盧小偉，馬珍珍，王威

湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院心內科，湖北十堰442000

缺血性心臟病主要由心肌冠狀動脈狹窄或閉塞引起，是常見的心血管疾病之一，其發病率、病死率均較高。及時恢復冠狀動脈血流是減輕心肌缺血損傷最有效的干預措施，但可能出現心肌缺血/再灌注(I/R)損傷[1]。欖香烯(β-elemene)是從我國傳統藥用植物莪術中分離的倍半萜，是一種新型抗癌藥物，可用于卵巢癌、乳腺癌和肺癌等治療[2]。β-elemene還具有強大的抗炎作用，通過減輕炎癥減少創傷性腦損傷大鼠的神經元損傷[3]。研究證實，微小RNA是心血管疾病的關鍵調節因子，與心血管損傷有關[4]。既往研究表明，脊髓損傷大鼠miR-130b-5p表達降低，人參皂苷Rb1通過上調miR-130b-5p表達減弱小膠質細胞介導的炎癥反應和神經元損傷來減輕脊髓損傷[5]。缺氧/復氧(H/R)是心肌I/R損傷的重要病理過程，2018年11月—2019年8月，本研究以H/R誘導的心肌細胞模擬心肌I/R損傷過程[6]，探討β-elemene對心肌細胞I/R損傷的影響，并闡明其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9C2購于中國科學院典型培養物保藏中心；miR-130b-5p模擬物(miR-130b-5p mimics)、抑制物(anti-miR-130b-5p)以及各自陰性對照(miR-NC、anti-miR-NC)購于上海吉瑪制藥技術有限公司；β-elemene(純度≥99.4%，批號100268-201903)購于中國食品藥品檢定研究院；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法凋亡檢測試劑盒、細胞計數試劑盒(CCK-8)購于北京索萊寶公司；大鼠IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于上海康朗生物公司；兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、磷酸化的核因子κB-p65(p-p65)、磷酸化的核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)、β-actin抗體購于上海鈺博生物科技有限公司。

1.2 細胞培養和H/R損傷模型構建 H9C2細胞用DMEM培養基(加有10%胎牛血清)在37 ℃、含5% CO2和95%空氣的培養箱中培養。按照1∶2比例傳代，2 d換液1次。參照劉丹等[6]實驗方法，構建H9C2細胞H/R損傷。

1.3 細胞分組及轉染 取2×105個H9C2細胞接種至6孔板，將細胞分組。NC組未處理；H/R組構建H/R損傷模型；不同濃度(25、50、100 μg/mL)β-elemene+H/R組分別加入25、50、100 μg/mL的β-elemene對H9C2細胞預處理6 h，再進行H/R；miR-NC+H/R組、miR-130b-5p+H/R組、anti-miR-NC+H/R組、anti-miR-130b-5p+H/R組分別轉染(利用Lipofectamine3000試劑進行瞬時轉染)miR-NC、miR-130b-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-130b-5p 48 h后進行H/R；anti-miR-NC+100 μg/mL β-elemene+H/R組、anti-miR-130b-5p+100 μg/mL β-elemene+H/R組先用100 μg/mL的β-elemene預處理轉染anti-miR-NC、anti-miR-130b-5p 48 h的H9C2細胞6 h后進行H/R。

1.4 細胞活力檢測 采用CCK-8實驗。細胞按照上述分組處理后，將H9C2細胞按照1×103/孔密度接種到96孔板中，將10 μL的CCK-8試劑添加到每孔中，然后將細胞在培養箱繼續孵育2 h，并通過酶標儀在450 nm激發光下測量光密度(OD)值。

1.5 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。用1×磷酸鹽緩沖鹽水洗滌各組細胞兩次，并用1×結合緩沖液調整為1×105/mL的單細胞懸液，使用AnnexinV-FITC和PI對細胞進行染色，在流式細胞儀上測試各組細胞樣品，采用Flowjo軟件分析結果。

1.6 細胞培養液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測 收集各組細胞培養液上清，按照大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒說明書步驟測定相應炎性因子水平。

1.7 細胞中Cleaved-caspase-3、p-p65和p-IκBα蛋白表達檢測 采用Western blotting法。向各組細胞中加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。通過BCA法測定濃度，在100 ℃下加熱5 min時蛋白變性。在電泳槽每個孔中添加20 μg蛋白樣品，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉1 h，加入1∶1 000稀釋的Cleaved-caspase-3、p-p65和p-IκBα一抗4 ℃過夜。在室溫下添加第二抗體孵育1 h。加入增強化學發光試進行顯影。Quantity One軟件掃描灰度值。β-actin作為內部對照，以目的蛋白/內部參照表示每種蛋白相對表達量。

1.8 細胞中miR-130b-5p表達檢測 采用實時定量PCR技術。按照TRIzol試劑使用說明從各組H9C2中提取總RNA。為量化miR-130b-5p表達，利用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將1 μg RNA反轉錄為cDNA，再采用miRcute miRNA PCR試劑盒在ABI 7500實時PCR系統進行PCR。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-130b-5p相對表達量。

2 結果

2.1 β-elemene對H9C2細胞活力和凋亡的影響 與NC組比較，H/R組細胞活力降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率升高(P均<0.05)；與H/R組比較，不同濃度(25、50、100 μg/mL)β-elemene+H/R組細胞活力升高，Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量、細胞凋亡率降低(P均<0.05)。見表1。

表1 不同濃度β-elemene對H9C2細胞活力和凋亡的影響

2.2 β-elemene對H9C2細胞炎性因子水平的影響 與NC組比較，H/R組細胞培養液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P均<0.05)；與H/R組比較，不同濃度(25、50、100 μg/mL)β-elemene+H/R組細胞培養液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P均<0.05)。見表2。

表2 不同濃度β-elemene對H9C2細胞炎性因子水平的影響

2.3 β-elemene對H9C2細胞miR-130b-5p表達的影響 與NC組比較，H/R組miR-130b-5p相對表達量降低(0.34±0.03 vs 1.00±0.10，P<0.05)；與H/R組比較，不同濃度(25、50、100 μg/mL)β-elemene+H/R組miR-130b-5p相對表達量升高(0.62±0.06、0.86±0.07、0.95±0.09 vs 0.34±0.03，P均<0.05)。

2.4 miR-130b-5p轉染對缺氧復氧H9C2細胞活力、凋亡及炎性因子表達的影響 與miR-NC+H/R組比較，miR-130b-5p+H/R組miR-130b-5p相對表達量、細胞活力升高，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量及細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P均<0.05)。見表3。

表3 miR-130b-5p轉染對缺氧復氧H9C2細胞活力、凋亡及炎性因子表達的影響

2.5 抑制miR-130b-5p對缺氧復氧H9C2細胞活力、凋亡及炎性因子表達的影響 與anti-miR-NC+H/R組比較，anti-miR-130b-5p+H/R組miR-130b-5p相對表達量、細胞活力降低，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量以及細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P均<0.05)；與anti-miR-NC+100 μg/mL β-elemene+H/R組比較，anti-miR-130b-5p+100 μg/mL β-elemene+H/R組miR-130b-5p相對表達量、細胞活力降低，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量以及細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P均<0.05)。見表4。

表4 抑制miR-130b-5p對心肌細胞H9C2活力、凋亡及炎性因子表達的影響

2.6 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較 與NC組比較，H/R組p-p65和p-IκBα表達升高(P均<0.05)；與anti-miR-NC+H/R組比較，anti-miR-130b-5p+H/R組p-p65和p-IκBα表達升高(P均<0.05)；與anti-miR-NC+100 μg/mL β-elemene+H/R組比較，anti-miR-130b-5p+100 μg/mL β-elemene+H/R組p-p65和p-IκBα表達升高(P均<0.05)。見表5。

表5 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較

3 討論

β-elemene具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經保護等多種藥理作用。研究表明，β-elemene通過調控細胞存活、凋亡、侵襲、轉移、放化療耐藥在宮頸癌[7]、膀胱癌[8]、膠質瘤[9]、胃癌[10]中具有治療作用。在脊髓損傷大鼠模型中，β-elemene還可降低IL-1β和IL-6的分泌水平，促進神經元存活并減少神經元凋亡進而改善運動功能[11-12]。本研究表明，β-elemene可提高H/R誘導下H9C2細胞活力，抑制細胞凋亡。Caspase-3被認為是Caspase家族的關鍵蛋白酶，其激活可引起DNA損傷修復酶的降解，激活內切酶，誘導細胞凋亡[13]。本研究中β-elemene作用后H/R誘導的H9C2細胞中促凋亡Cleaved-caspase-3蛋白表達降低，這與β-elemene的抗凋亡作用一致。除心肌細胞凋亡外，炎癥反應亦是心肌I/R損傷中的重要生物過程。正常生理條件下心肌細胞TNF-α表達較低，當心肌I/R損傷時受損細胞釋放出大量促炎因子TNF-α，并誘導其他炎癥因子如IL-1β和IL-6釋放，進一步擴大炎癥反應[14]。本研究中β-elemene處理可降低H/R誘導后TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平。這些研究表明，β-elemene是一種潛在的心肌細胞I/R損傷治療藥物。

一直以來，miR-130b-5p被認為是人類疾病進展的調節因子。據報道，miR-130b-5p在食管鱗狀細胞癌[15]、胃癌[16]中高表達，并促進癌細胞增殖和遷移。前列腺癌中miR-130b-5p表達降低，上調miR-130b-5p表達具有抗轉移作用[17]。此外，miR-130b-5p在神經元發育中具有功能作用，通過上調miR-130b-5p表達能抑制急性脊髓損傷大鼠模型和缺氧細胞模型神經元凋亡[18]。然而，尚不清楚miR-130b-5p在心肌細胞I/R損傷中的作用。通過轉染miR-130b-5p mimics或anti-miR-130b-5p進行功能驗證發現，過表達miR-130b-5p提高H/R誘導下H9C2細胞活力，抑制細胞凋亡，降低TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平，進而減輕心肌細胞H/R損傷，然而抑制miR-130b-5p表達則加劇心肌細胞H/R損傷。由于β-elemene干預后H/R誘導的H9C2細胞中miR-130b-5p表達升高，提示β-elemene對心肌細胞I/R損傷保護作用可能與調控miR-130b-5p表達有關。深入研究發現，抑制miR-130b-5p表達減弱β-elemene對H/R誘導的H9C2細胞活力、凋亡以及促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響，這進一步說明上調miR-130b-5p是β-elemene發揮心肌細胞H/R損傷保護作用的重要機制。

NF-κB是一類關鍵性核轉錄因子，其幾乎存在于所有類型細胞中，在調節細胞生長、炎癥和免疫反應中起重要作用。近年研究指出，中藥化合物、miRNAs等通過抑制NF-κB信號傳導抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，進而保護大鼠心肌I/R損傷[19-20]。本研究結果顯示，抑制miR-130b-5p表達增加H/R誘導后H9C2細胞中p-p65和p-IκBα表達，促進NF-κB活化，并減弱β-elemene對H/R誘導的H9C2細胞NF-κB活化的抑制作用。這說明β-elemene通過上調miR-130b-5p表達抑制NF-κB活化進而發揮心肌細胞H/R損傷保護作用。

綜上所述，β-elemene可提高H/R誘導下心肌細胞活力，抑制細胞凋亡，減弱炎癥反應進而減輕心肌細胞H/R損傷，其機制與上調miR-130b-5p表達、抑制NF-κB信號通路有關。