超聲-微泡介導miR-128通過調節PTEN抑制乳腺癌細胞阿霉素耐藥

翁沛華

廣州市第一人民醫院(廣州 510180)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，化療是各期病程的乳腺癌治療的重要手段，乳腺癌的化療藥物也得到了不斷的發展和補充。阿霉素是目前臨床乳腺癌治療中廣泛應用的化療藥物之一。然而，約有70%的乳腺癌患者對其耐藥或很快出現化療耐藥。miRNA通過與靶基因mRNA分子的3端非編碼區(3’UTR)結合，抑制基因表達，參與調控生物生長和發育等過程。其中，miR-128被報道與許多腫瘤發生發展和耐藥相關，然而其在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用和具體機制仍不明確。此外，多數靶向藥物或小分子因為無法實現在腫瘤部位的靶向聚集并滲透到腫瘤內部，導致治療乳腺癌效果不佳。超聲-微泡攜帶藥物或基因靶向治療腫瘤是近年來超聲分子影像學的研究領域的熱點，在腫瘤早期的檢測和療效評價方面具有可觀的應用前景。因此，探索超聲-微泡介導miR-128在乳腺癌阿霉素中的作用和具體分子機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胎牛血清和RPMI 1 640培養基購買自GLIBO公司，RNA提取試劑盒購買自AMBION公司，逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)試劑SYBR Green購買自Roche，CCK8試劑盒購買自Roche，miR-128和β-actin的PCR引物購買自銳博生物。

1.2 細胞培養

人乳腺癌細胞MCF-7和阿霉素耐藥細胞系MCF-7/ADM，用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培養基并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內，取對數期、生長狀態良好的細胞進行實驗。

1.3 制備載miR-128陽離子脂質微泡

制備陽離子脂質微泡，每次實驗前，通過陽離子微泡和miR-128孵育后進行DNA瓊脂糖凝膠電泳的實驗，測試出二者最佳孵育比例，每次處理細胞前，按每1 μg質粒與107～108個的微泡的比例共同孵育miR-128和陽離子脂質微泡30 min，得到載miR-128陽離子脂質微泡。

1.4 轉染

將細胞以8 103個/孔濃度接種于96孔板，待培養密度約30%～50%匯合時進行siRNA轉染。采用Oligofectamine Reagent轉染試劑盒，選用miR-128過表達質粒進行轉染，按試劑說明書操作。加入轉染液培養4小時后，更換含有10%胎牛血清RPMI 1640培養液繼續培養。

1.5 qPCR實驗

利用TRIZOL法提取總RNA，根據Roche逆轉錄試劑盒對提取的RNA進行逆轉錄，使用3步法進行qPCR程序擴增，預變性95 ℃，3 min；變形95 ℃，3 s；退火56 ℃，34 s；延伸72 ℃，10 s，共40個循環，由2-△△Ct計算相對表達量。實驗所需引物如下：miR-128,forward:5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′；reverse：5′-TCACAGTGAACCGGTCTC-3′；β-actin，forward:5′-CTCGCCTTTGCCGATCC-3′；reverse：5′-GGATC TTCATGAGGTAG-TCA-3′。

基于SYBR熒光強度與雙鏈DNA含量之間呈正相關的原理，實時熒光定量PCR可以通過檢測熒光強度來計算基因表達。10 μL系統配置如下：

2 SYBR 5 μL

F+R 0.4 μL

cDNA 1 μL

DEPC 3.6 μL

總量 10 μL

注意：避免光照并在冰上操作。每個反應組需要設置3個側孔，miRNA需要以U6作為內部參照，共同基因需要以β-actin作為內部參照。反應條件完成后，使用96孔板或八個連續的板來排列和添加樣品，然后將它們放入Bio-Bad熒光定量PCR儀中，反應條件：5 ℃ 2 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)39 個循環。

1.6 CCK8實驗

不同的細胞處理種植在96孔板上，根據實驗設計加入阿霉素并培養，利用CCK8檢測細胞活性并計算不同處理細胞阿霉素的藥物IC50。主要實驗步驟如下：

(1)在96孔板中接種不同處理的細胞(100 μL/孔)。將培養板先放在培養箱中一段時間(在37 ℃，5% CO2)；

(2)向每孔加入10 μL 的CCK8溶液(注意孔中不要有氣泡生成)；

(3)將準備好的培養板放在培養箱內1～6小時；

(4)用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.7 統計學分析

實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件進行分析，多組間兩兩比較采用完全隨機設計資料的方差分析，分析前進行方差齊性檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-128在阿霉素耐藥乳腺癌細胞中低表達

為研究miR-128在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用，我們前期構建了人乳腺癌細胞MCF-7和阿霉素耐藥細胞系MCF-7/ADM，并通過qPCR檢測了miR-128在親代乳腺癌細胞MCF-7和阿霉素耐藥的乳腺癌細胞MCF-7/ADM中的表達。實驗結果顯示，miR-128在阿霉素耐藥乳腺癌細胞中低表達(圖1)，且結果有統計學意義(P<0.05)。

圖1 qPCR檢測miR-128在阿霉素耐藥乳腺癌細胞中低表達(P<0.05)

2.2 超聲-微泡介導miR-128增強乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性

為驗證miR-128在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用，我們在親代人乳腺癌細胞中過表達miR-128，CCK8實驗檢測MCF-7過表達miR-128組和對照組阿霉素IC50的變化，以及檢測超聲-微泡miR-128組乳腺癌阿霉素IC50的變化。實驗結果顯示過表達miR-128能夠增加乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性，超聲-微泡介導的miR-128進一步增強了乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性(圖2)，且結果差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 超聲-微泡介導miR-128降低乳腺癌細胞阿霉素IC50(P<0.05，OE：過表達，UM：超聲-微泡)

2.3 miR-128通過調節PTEN從而抑制乳腺癌細胞對阿霉素耐藥

為研究miR-128調控乳腺癌細胞阿霉素敏感性的具體分子機制，我們在阿霉素耐藥乳腺癌細胞中過表達miR-128后，qPCR檢測PTEN的RNA表達水平。以及在阿霉素耐藥乳腺癌細胞中過表達miR-128且過表達PTEN后，CCK8檢測阿霉素IC50變化。實驗結果顯示，在阿霉素耐藥乳腺癌細胞中過表達miR-128后，PTEN的RNA表達降低(圖3)，且結果差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 qPCR檢測過表達miR-128后PTEN的mRNA水平(P<0.05，OE：過表達)

且阿霉素耐藥乳腺癌細胞中加入超聲-微泡miR-128且過表達PTEN后，乳腺癌細胞對阿霉素恢復抗性(圖4)，且結果差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 CCK8檢測超聲-微泡miR-128且過表達PTEN卵巢癌阿霉素IC50(P<0.05，OE：過表達)

3 討 論

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，化療是治療乳腺癌最重要的手段之一。但多達50%～70%的患者會出現顯著的耐藥，嚴重影響了患者的生存預后。因此，尋找安全有效的治療方法治療乳腺癌化療耐藥具有重要研究價值?；谶@些原因，根據國內外的研究和前期的研究結果，我們提出超聲-微泡介導miR-128通過調節PTEN抑制乳腺癌細胞阿霉素耐藥的研究。在既往工作基礎上，結合國內外研究重點，重點研究超聲-微泡介導miR-128特異性靶向乳腺癌化療耐藥，有望為增強乳腺癌化療耐藥提供新的方法，為尋找和解決乳腺癌化療耐藥提供新的理論依據。我們通過qPCR檢測miR-128在乳腺癌細胞系中的表達，并利用超聲技術制備脂質微泡探究超聲-微泡介導的miR-128對乳腺癌細胞阿霉素耐藥的影響，CCK8實驗檢測乳腺癌細胞的活性；qPCR檢測過表達miR-128后對PTEN的影響和對乳腺癌細胞阿霉素耐藥的影響。miR-128在乳腺癌的發生發展過程中起重要作用,可以和RECK相互影響調控乳腺癌細胞的生物學行為,提示miR-128和RECK可能成為乳腺癌的潛在治療靶標[3]。此外，miR-128被證明參與多種腫瘤化療耐藥，余曉玲的研究發現miR-128能夠靶向Rap1B影響腦膠質瘤細胞增殖、侵襲及化療敏感性[4]。在結直腸癌中，miR-128基因的超甲基化能導致NEK2的表達顯著上調，可能通過對NEK2的調節改變腫瘤細胞的耐藥型。陳云云研究發現miR-128與乳腺癌的紫杉醇耐藥性有關，可以用于判斷患者的紫杉醇耐藥情況[6]。我們實驗結果表明miR-128過表達可以增強乳腺癌對阿霉素的敏感性。進一步在乳腺癌中深入發現miR-128的作用，為揭示miR-128在乳腺癌中的作用提供了新的思路。載藥超聲-微泡的靶向治療是當前醫藥領域中的研究熱點。超聲-微泡破壞技術介導的靶向藥物和基因治療是一種最新的靶向治療方法。超聲-微泡不僅可以作為一種超聲造影劑增強成像對比度,更可以通過各種物理、化學修飾攜帶各種藥物或基因在超聲場強破壞作用下進行靶向治療。近年來，應用微泡造影劑對乳腺癌進行靶向治療成為超聲分子影像學研究的重點領域，在早期腫瘤檢測和治療中具有良好的應用前景[7]。微小RNA(microRNA, miRNA)是由20～22個核苷酸組成的非編碼區單鏈RNA，通過與靶mRNA的3′非翻譯區相互作用，負向調控基因表達，抑制蛋白質的合成。前面我們已經證明miR-128介導了乳腺癌阿霉素耐藥，因而利用靶向miR-128治療乳腺癌阿霉素耐藥成為了可能。然后，由于miRNA在體內易被降解，因此需要載體將其遞送到靶組織，超聲-微泡作為一種非侵入性和組織特異性的基因傳遞技術，安全性高、穩定性好、轉染效率高，避免了基因在血液循環中的降解。Qin等[8]研究了超聲-微泡介導的miR-205在前列腺癌發生發展中的作用，發現超聲-微泡介導miR-205可有效抑制前列腺癌的發生發展。Yang等[9]利用超聲-微泡將miR-let-7b轉染到OCSCs中，結果表明超聲-微泡聯合miR-128為卵巢癌的基因治療提供了良好的治療策略。因此，利用超聲-微泡載miR-128治療乳腺癌阿霉素耐藥被我們進一步研究。結果發現，超聲-微泡介導的miR-128進一步增強了乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性，進一步探索超聲-微泡介導miRNA特異性靶向乳腺癌增敏化療療效的研究，盡管超聲聯合微泡增敏化療的相關研究目前尚未完全成熟，仍處于臨床應用的早期，但其作為一種無創的輔助治療手段，提高了腫瘤局部藥物濃度，具有廣泛的應用前景。今后隨著研究的逐漸深入和各項技術不斷優化，其將在臨床中得到更廣泛的應用,有望為乳腺癌治療提供新的理論基礎和實驗方案。