紅肉蘋果炭疽病病原鑒定及其生長適應性研究

劉在哲,葛磊,季延平,張雨桐,趙濤,亓玉昆,張玉嬌,王清海*

紅肉蘋果炭疽病病原鑒定及其生長適應性研究

劉在哲1,2,葛磊3,季延平2,張雨桐4,趙濤5,亓玉昆2,張玉嬌1,王清海2*

1. 濟南市林場, 山東 濟南 250014 2. 山東省林業科學研究院, 山東 濟南 250014 3. 山東省林草種質資源中心, 山東 濟南 250102 4. 福建師范大學, 福建 福州 350108 5. 泰安市徂徠山林場, 山東 泰安 271027

為明確紅肉蘋果的侵染病菌種類及其生長適宜條件，本文采用形態學、致病性以及多基因系統發育分析，并測定其培養基類型、溫度、pH、光照適宜生長條件。結果表明：暹羅炭疽菌（）為其侵染病菌；馬鈴薯蔗糖培養基（PSA）、沙氏培養基（SDA），25 °C～30 °C,pH 8.0～10.0，持續光照或黑暗交替（12h:12h）等環境條件適宜菌絲生長。

暹羅炭疽菌; 病原鑒定; 生物學

蘋果適應性廣、營養價值高、耐貯存，是世界性水果之一。據FAO統計，2019年全球蘋果結果面積4,717,384 hm2，產量87,236,221 kg，中國蘋果結果面積2,041,197 hm2，產量42,426,578 kg，在種植面積和總產量方面位列世界第一。然而，就單位面積產量來看，世界蘋果主產國美國、法國、意大利的平均單位面積產量分別為420,468 hg/hm2、348,124 hg/hm2、418,853 hg/hm2，而中國僅為207,851 hg/hm2(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)，單位面積產量遠遠低于美國、法國、意大利。其中，病蟲害危害是重要的原因之一。

蘋果在生長季節容易受到多種病害的侵染，嚴重影響蘋果的產量和果實品質，其中由炭疽菌屬（sp.）真菌引起的蘋果炭疽?。喔?、葉枯?。┦侨蚍秶鷥纫活愖钪匾恼婢『?，造成嚴重的經濟損失。炭疽菌屬真菌是全球分布的一類重要的植物病原真菌，可以侵染多種谷類作物、水果、蔬菜以及觀賞植物等寄主，造成嚴重的經濟損失[1-3]。由于其重要的科學及經濟價值，炭疽菌屬真菌已經成為全球第八類重要的植物病原真菌[4]，對全球農林業生產構成了嚴重威脅。

目前已知可以侵染蘋果的炭疽菌屬真菌有(巴西、韓國、美國)[5-8]、（韓國、巴西、美國、日本）[6-11]、（韓國、美國、比利時、法國、斯洛文尼亞）[6,8,12-14]、s.s.（韓國）[6]，（韓國、美國、日本）[6,8,10]、（巴西）[7]（巴西）[7]（巴西）[7](捷克、比利時、新西蘭、烏拉圭)[12,15-17]（巴西）[18]（美國）[8]（挪威）[19]（日本）[10]（美國）[20]sp. nov.（美國）[20]（比利時）[12]（比利時）[21]（比利時、英國、斯洛文尼亞）[12,14,21]（烏拉圭）[17]。

蘋果炭疽病是中國蘋果各產區的一種的重要植物病害。已有的報道表明，在中國引起蘋果炭疽病的炭疽菌主要有、、、、、、（中國）[22,23]。

近些年來，隨著人們對功能性水果的迫切需求，紅肉蘋果（）是新疆野蘋果的一種變種，原產于中國及哈薩克斯坦。由于其富含花青苷、綠原酸、原兒茶酸、根皮苷等多種保健功能物質以及亮麗的外觀品質，作為功能果品，美國、加拿大、日本、中國、新西蘭等多個國家的蘋果育種專家相繼開展了相關的研究。截止目前，已有的3000余份紅肉蘋果資源或品種（系），均是新疆紅肉蘋果直接或間接的后代。2015年，山東省種植的紅肉蘋果，炭疽病發生嚴重，病果率達到50%以上，嚴重的園區甚至絕產，嚴重影響紅肉蘋果產業的健康發展。因此完全有必要對紅肉蘋果炭疽病病原進行系統研究，明確其生物特性，為紅肉蘋果炭疽病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病紅肉蘋果果實，從山東省濟南市唐王鎮紅肉蘋果種植園采集。

1.2 方法

1.2.1 紅肉蘋果炭疽病病組織分離及分離菌單孢培養 采用組織分離法。樣品用70%乙醇表面消毒后，利用滅菌的解剖刀在果實病健交界處3～4 mm2的組織塊，先用1%次氯酸鈉浸泡1 min，然后再用70%乙醇溶液浸泡1 min，最后無菌水沖洗3次。置于PDA平板上，每個平皿放置5塊，28 ℃培養5 d，挑取單個菌落菌絲，轉移到新的PDA平板上，28 ℃下培養7 d，采取孢子稀釋分離法獲取單菌落。將單菌落菌株培養后移于斜面試管中，4 ℃保存。所有菌種均保存于山東省林業科學研究院森林保護研究所實驗室。

1.2.2 分離菌致病性測定 采用離體接種法。品種為‘玖紅蘋果’。選擇無病無蟲傷的蘋果果實、葉片，用自來水沖洗干凈，晾干后，用75%酒精表面消毒，備用。將供試菌株在PDA培養基上培養5 d，在菌落邊緣用打孔器制作菌餅（φ = 5 mm），以空白PDA培養基為對照，用無菌的接種針（φ = 0.5 mm）輕微刺傷果實、葉片，每片葉接種1片菌餅、每個果實接種3片菌餅，每個處理葉和果實各5片（個），試驗重復2次。將處理后的果實、葉片置于滅菌的燒杯中，用保鮮膜密閉燒杯，保持一定濕度，置于28℃的恒溫培養箱中培養5 d，觀察。

1.2.3 病原鑒定

1.2.3.1形態特征觀察 （1）菌落形態觀察將分離獲得的紅肉蘋果炭疽病菌菌株在PDA培養基平板活化培養5 d，在菌落邊緣利用打孔器制作菌餅（φ = 5 mm），將菌餅置于PDA平板中央，每個平板置1塊菌餅，28 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養5 d，觀察記錄菌落特征。

（2）菌株分生孢子、附著胞及產孢特征顯微觀察將分離獲得菌株接種到PDA平板上，28 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養5 d，以無菌水為浮載劑，挑取培養基上的小粒點，用蓋玻片輕輕壓碎，在蓋玻片上滴香柏油，封住蓋玻片四周，室溫下放置24 h，利用Nikon50i顯微鏡（Nikon Eclipse 50i，日本）觀察分生孢子、附著胞、產孢梗以及產孢細胞形態，利用QImaging 照相系統（QImaging加拿大）拍照，利用cellSens軟件測量分生孢子、附著胞大小。

1.2.3.2菌株DNA提取及保守基因序列的擴增與測序分析DNA提取采用改進的CTAB法[24]。選擇的目的基因分別為核糖體轉錄間隔區序列（ITS）、肌動蛋白基因（）、幾丁質合成酶A基因（）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（）、β-微管蛋白基因（）和鈣調蛋白基因（）進行擴增與測序。試驗所用引物見表1，反應體系：25 μL，包括Taq酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板2 μL。PCR產物由上海派森諾生物科技有限公司進行雙向測序。

將各個菌株的ITS、、、、和基因序列提交到GenBank數據庫中，基因編號見表2。將獲得的各個序列在Q-bank（www.q-bank.eu）數據庫中進行比對。選取44株菌株，其中（MAFF 305972）作為外圍菌株。利用MEGA 7.0中的Clustal W對各基因序列進行比對，將校正后的各基因利用Fasta alignment joiner軟件（http://users-birc.au.dk/biopv/php/fabox/alignment_joiner.php#）以首尾相連的方法合并（--1--ITS--），利用MEGA7.0軟件采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建多基因系統發育樹，以自展法（Bootstrap）進行檢測，共循環1000次。

1.2.4 紅肉蘋果炭疽病菌生長適應性測定分別設置不同培養基（PDA培養基、PMA培養基、玉米粉瓊脂培養基CMA、PSA培養基、燕麥片培養基OA、沙氏培養基SDA和馬丁氏培養基Martin）、不同溫度（5 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、不同pH（5、6、7、8、9、10）、不同光照條件（12 h日光燈交替照射、日光燈24 h持續照射、連續黑暗）等處理，接種生長一致的紅肉蘋果炭疽病菌菌餅（φ = 9 mm），28 ℃培養5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。每個試驗處理重復3次，平行測定4次。

表1 PCR擴增所用引物及反應程序

表2 用于系統發育分析的參考菌株序列

粗體表示的是模式菌株，*表示的是研究菌株 Ex-type strains or authentic cultures are in bold. * Strains collected in this study

1.2.5 數據處理與分析利用Spss 20.0軟件進行數據處理，差異顯著性分析采用Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 紅肉蘋果炭疽病癥狀

主要危害果實，發病初期，病斑圓形、淺褐色、邊緣清晰，斑點周圍有時會有紅色圓圈。后病斑逐漸擴大，病斑中央凹陷，產生輪紋狀排列的黑色小粒點（分生孢子盤），在分生孢子盤上產生粉紅色或橘紅色粘性物質（分生孢子）。病害后期，病斑擴大至半個果面（圖1），造成果實早落，或在掛在樹枝上成為僵果。

圖1 紅肉蘋果炭疽病田間癥狀

2.2 分離菌株致病性

接種分離菌菌餅的果實和葉片，5 d后均表現出炭疽病癥狀（圖2），發病率為100％，對照未表現出癥狀。果實上病斑圓形或近圓形，中央凹陷，黑色小粒點輪紋狀排列，產生橘紅色粘質孢子堆（圖2a）。葉片上病斑擴展受葉脈限制，病部有小黑點產生，溢出橘紅色粘質孢子堆（圖2b）。癥狀均與田間紅肉蘋果植株發病癥狀一致，并且從接種的果實、葉片的病斑上分離到的菌株與原來接種菌株形態特征一致。表明，分離到的菌株為紅肉蘋果炭疽病的病原菌。

圖2 致病性試驗

(a)果實接種后病斑 Necrotic lesion on red-fleshed apple fruits; (b) 葉片接種后病斑 Necrotic lesion on red-fleshed apple leaves

2.3 紅肉蘋果炭疽病菌形態特征

在PDA培養基上最初為白色，隨后在接種點附近產生分生孢子盤及橘紅色分生孢子堆。氣生菌絲白色，棉絮狀，濃密（圖3a）。分生孢子盤黑色或者褐色，圓形或不規則圖形，無剛毛。分生孢子梗透明、有隔膜、無分枝（圖3b）。分生孢子為單細胞、無色、光滑、圓柱形或橢圓形（圖3d），大小為16.7±1.5×6.1±0.9 μm，=50，長寬比為2.9。附著胞側生或頂生，卵圓形或橢圓形（圖3c），大小為9.2±1.6×8.0±1.8 μm (=20)。菌株形態特征、培養性狀符合復合種的特征描述。

圖3 紅肉蘋果炭疽病菌形態特征

(a) 菌落形態，(b) 分生孢子盤，分生孢子梗，產孢細胞，(c) 附著胞，(d) 分生孢子

(a) Cultural characters. (b) Acervulus, conidiophores, and conidiogenous cell. (c) Appressoria. (d) Conidia Bars=50 μm

2.4 紅肉蘋果炭疽病菌多基因序列分析

將獲得的11株菌株（JNTW11、JNTW12、JNTW13、JNTW14、JNTW15、JNTW2、JNTW22、JNTW33、JNTW43、JNTW53、JNTW63）與44株對比菌株的ITS、、、、、的基因序列，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構建多基因系統發育樹（圖4）。所有模式菌株以粗體表示，自展率標于節點處，標尺指示為0.02步變化。系統發育樹最高對數似然值為-8852.79。本試驗獲得的11株菌株與聚在一個分支上，自展率為93%，結合分離菌株的形態特征、培養性狀，本試驗獲得菌株為。

2.5 紅肉蘋果炭疽病菌的生長適應性

2.5.1 不同培養基對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響由圖5可以看出，培養基不同，紅肉蘋果炭疽病菌（菌株JNTW33、JNTW11、JNTW2）菌絲生長狀況不同。菌株JNTW11在SDA培養基上生長最好，菌絲生長速率為1.67 ± 0.84 cm/d，在<0.01水平上具有顯著性差異。CMA培養基不適宜菌株JNTW11生長，菌絲生長速率僅為0.99 ± 0.09 cm/d。菌株JNTW33和JNTW2最適的培養基為PSA、SDA培養基，在CMA、Martin及OA培養基上生長最差。

圖4 利用最大似然法基于紅肉蘋果炭疽病菌ITS、GAPDH、ACT、CHS-1、TUB2和CAL的基因數據構建的系統發育樹

2.5.2 溫度對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響圖6結果表明，紅肉蘋果炭疽病菌在溫度低于5 ℃或高于35 ℃的環境中受到抑制，生長緩慢。適宜菌株生長的溫度為30 ℃。

圖5 不同培養基對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響

圖6 不同溫度對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響

2.5.3 pH對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響適宜紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的pH值范圍較廣，在pH 5.0 - 10的范圍內菌絲均能正常生長。不同菌株對酸堿度的適應性不同，在pH 5.0 - 10之間，pH值對菌株JNTW33、JNTW2菌絲生長無顯著性影響；而對JNTW11菌株菌絲生長具有顯著性影響，生長速度在0.01水平上具有顯著性差異（圖7）。

2.5.4 光照條件對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響圖8結果表明，光照對3株紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長速度的影響趨勢一致。與持續黑暗相比，持續光照或12 h交替照射條件下更適宜3株菌株生長，菌絲生長速度在< 0.01水平上具有顯著性差異。

圖7 不同pH對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響

圖8 光照對紅肉蘋果炭疽病菌菌絲生長的影響

3 結論與討論

紅肉蘋果富含有機酸、蘋果酸、多酚類物質（綠原酸、原兒茶酸、花青苷、根皮苷等）、三萜類物質等營養物質，能夠有效防止人體細胞、組織或器官因氧化應激反應所導致的氧化損傷，具有多種保健功能，因而具有重要的營養價值和藥用價值。紅肉蘋果正處于選育、引種階段，尚未大面積種植，但在一些種質園，紅肉蘋果炭疽病發生較重，嚴重影響紅肉蘋果的推廣利用。為有效控制炭疽病的危害，明確病原種類是十分必要的。

炭疽菌屬真菌1790年首次發現，直到1831年Corda才首次建立炭疽菌屬。炭疽菌屬真菌具有豐富的種群多樣性，其形態特征、培養性狀、致病力以及遺傳變異較大，有些近似種之間差異微小，而且有時會有多種炭疽菌同時存在同一寄主的現象。所以僅僅根據形態學特征、寄主范圍以及ITS序列進行鑒定，結果可能并不準確。隨著形態學、致病性以及多基因的系統分析等綜合方法的應用，一些炭疽菌新種不斷被發現，一些原來的種被廢棄。本研究利用形態學結合ITS、、、、和等多基因系統發育分析，明確了引起紅肉蘋果炭疽病的病原菌為暹羅炭疽菌（）。

目前，蘋果屬下已接受的種62個。已有的文獻報道炭疽菌危害的有，，，和。危害的炭疽菌有,,,,,,,,,,,[9,12,16,21]；危害的炭疽菌有，,,,,,[12,17,25,26]；危害的炭疽菌有[27]；危害的炭疽菌有s.l.[28]；危害的炭疽菌有，[29]。本文是首次發現報道侵染危害。

暹羅炭疽菌在泰國咖啡上首次發現，引起咖啡炭疽病[30]。暹羅炭疽菌寄主和分布范圍比較廣，在非洲、美洲、大洋洲、亞洲均有分布[31-34]。最新的研究報道，暹羅炭疽菌可以侵染危害番木瓜、圓形薯蕷、subsp.、草莓、杧果、刺果番荔枝、葡萄、桃、越桔、聚果榕、臺灣青棗、柑橘、油茶、黃麻、樟樹、蜘蛛蘭、蘭科植物、楊桃、毛白楊、草珊瑚、核桃、油桐、香港四照花、德保蘇鐵、金茶花、滴水觀音、茉莉花、椰子、黛粉葉、桂花、番石榴、紫荊花、洋蔥、印楝、石榴、紅蟬花、菠蘿蜜、枇杷、無花果、薄荷、鱷梨、胡椒、開心果、迷迭香、可可等多種植物。本研究首次發現暹羅炭疽菌侵染紅肉蘋果引起炭疽病，紅肉蘋果是其新寄主。目前，對暹羅炭疽菌的研究僅限于種名的鑒定，有關生物學、生態學、流行學、種群遺傳結構和有效的防治措施有待進一步研究。

弄清紅肉蘋果炭疽病菌的生物學特性是研究該病的重要基礎。本試驗選取了3個代表性菌株（JNTW11、JNTW2以及JNTW33）進行了生長適應性研究。在不同培養基上3株菌生長速率略有不同。適宜的培養基為SDA培養基、PSA培養基，適宜的溫度為25～30 ℃。菌株在pH 5.0～10.0范圍內能夠正常生長，適應的pH值范圍較廣。不同菌株對酸堿度的適應性不同，JNTW33和JNTW2菌株在pH 5.0～10.0之間菌絲生長速率在0.01水平上無顯著性差異，pH值對JNTW11菌株的菌絲生長影響較大，不同pH值下的菌落直徑在<0.01水平上具有顯著性差異，其中弱堿性環境更適宜菌絲生長。光照條件對3株菌株菌絲生長速率的影響具有一致性，黑暗條件不利于菌絲生長。病害的發生程度與菌株生物學特性密切相關。光照有利于菌絲生長，是否有更利于發病，還需要林間進一步調查研究。本研究結果明確了紅肉蘋果炭疽病的病原種類，弄清了其生長適應性，研究結果為預測病害發生和有效控制提供了基礎的理論依據。

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Identification and Characterization offrom Anthracnose Disease of Red-fleshed Apple and Adapation

LIU Zai-zhe1,2, GE Lei3, JI Yan-ping2, ZHANG Yu-tong4, ZHAO Tao5, QI Yu-kun2, ZHANG Yu-jiao1, WANG Qing-hai2*

1.250014,2.250014,3.250102,4.350108,5.271027,

Red-fleshed apple anthracnose is a disastrous disease caused bysp. occurred in red-fleshed apple orchards and germplasm gardens, and result in yield losses. So far, the pathogen and its characterization was largely unknown. It is necessary to identify accurately and characterize the pathogen responsible for red-fleshed apple in order to provide further information on effective means of controlling the disease. To verify the etiology of anthracnose on red-fleshed apple using multilocus phylogenetic analyses and morphological characteristics. To determine the effect of culture medium, temperature, pH, and light condition on hyphal growth rate using growth rate method. The results showed that 11 similar single-sporeisolates were obtained from the diseased fruits, and all single-spore isolates could cause the similar anthracnose symptoms. The pathogen of red-fleshed apple anthracnose was identified asbased on six-gene phylogenetic analyses (ribosomal DNA-ITS,,,,, and) and morphological as well as cultural characters.JNTW11, JNTW02, and JNTW33 isolates preferred PSA and SDA culture medium. The optimum condition for growth was 25°C to 30°C, pH value 8.0-10.0, and continuous light or alternate light condition. This is the first report ofas a causal agent of anthracnose of red-fleshed apple, andwas the new host plant toin the world.

pathogen identification; biology

S436.65

A

1000-2324(2021)05-0713-10

2021-10-09

2021-10-12

山東省農業重大應用技術創新課題;山東省林業科技創新項目(2019LY003-4)

劉在哲(1969-),男,高級工程師,主要從事林木病理學研究. E-mail:liuzaizhe1969@126.com

通訊作者:Author for correspondence.E-mail:wqhhai@126.com