免疫細胞調節腫瘤血行轉移的研究進展

唐 彧，鄭維維，錢 程，張 珊，楊春媚，王飛輝，陸 茵,2，王愛云,2

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2.南京中醫藥大學，江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

血行轉移是腫瘤細胞脫離原發灶并遠端定植的主要途徑。一旦腫瘤生長進行到血管依賴階段，就可以穿過血管壁，利用血液擴散，到達遠處器官，完成轉移[1]。除了血管系統外，淋巴系統也是血液循環系統的一個組成部位，淋巴管生成信號通路的持續激活抑制了淋巴管功能的正常化，增強腫瘤間質壓。間質壓的升高削弱了藥物到達腫瘤組織的程度，使得藥物不能有效抑制腫瘤細胞增殖和侵襲[2]。

腫瘤免疫細胞包括腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、轉移相關巨噬細胞(metastasis-associated macrophages，MAMs)、腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils，TANs)等先天免疫細胞，還有效應T細胞、B細胞等適應性免疫細胞。在腫瘤微環境的刺激下，免疫細胞依賴于病變腫瘤的募集，促血管和淋巴管生成因子、細胞因子的產生來調節血管和淋巴管生成，促進腫瘤血行轉移。Ogawa等[3]證實樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)可通過依賴于環氧合酶2/前列腺素E2(cyclooxygenase2/prostaglandin E2，COX2/PEG 2)的基質細胞衍生因子1 (stromal cell-derived factor-1，SCF-1)，在淋巴結轉移過程中誘導轉移前生態位的形成，促進上皮-間質轉化，從而實現腫瘤血行轉移。

浸潤的免疫細胞能夠通過促進血管生成加速腫瘤發展，降低臨床腫瘤治療的療效。經典的抗血管生成療法盡管可以抑制腫瘤的生長，但是未能改善患者的生存期，且存在耐藥等應用局限[4]。而聯合基于T細胞的抗程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)免疫檢查點療法，可以達到查漏補缺的功效，既可以填補抗血管生成療法的漏洞，又可以增加淋巴細胞的浸潤和活化程度。將抗血管生成療法和免疫檢查點抑制劑聯合使用，可以達到協同增效的效果，有效降低患者的腫瘤復發率。本文將會對免疫細胞如何影響腫瘤血管生成和淋巴管生成，以及相關的抗血管生成療法和免疫檢查點抑制劑進行綜述。

1 血行轉移是腫瘤轉移的關鍵環節

血管可以通過運輸營養物質、氧氣、代謝物等來維持免疫系統、體溫和 pH 值的穩定；在胚胎發育、身體生長和傷口愈合中起著重要作用。與正常組織一樣，腫瘤組織也需要血管來維持自身生長與代謝。在正常組織中，血管生成的啟動(稱為血管生成開關)受到嚴格調控；然而，在腫瘤發展過程中，促血管生成信號和抗血管生成信號之間的平衡被打破，使得血管生成開關總是處于被激活狀態[5]。

腫瘤新生血管的形成是實體瘤生長的限速步驟，實體瘤的脈管系統在大小、形狀和結構方面異常多樣，并且不按照傳統分級排列的方式進行分布。在乳腺癌小鼠的腫瘤血管中，其內皮細胞連接松散，重疊生長，并伸入血管腔。總之，腫瘤的脈管系統呈現非典型的形態特征，其特點是擴張、彎曲和紊亂，血管不成熟和附壁細胞的缺乏導致腫瘤的遷移能力增加。

腫瘤組織具有高度血管生成的能力，新生血管形成是腫瘤生長和轉移的重要階段。在血管生成過程中，來自成血管的內皮祖細胞在受局部環境刺激時被募集，分化為成熟的血管內皮細胞，最終形成血管。血管生成過程分為以下步驟：腫瘤細胞分泌促血管生成因子到細胞外液，激活內皮細胞。這些內皮細胞沿著促血管生成因子的濃度梯度遷移并附著在血管上，形成功能性血管網絡。

腫瘤血管在微環境條件下發生擴張，通透性和纖維蛋白滲出率顯著增加。同時，膠原酶激活和基底膜破裂促進細胞外基質重塑[6]。此外，血管生成因子誘導內皮細胞增殖，新的內皮細胞組裝成管狀結構，形成新的腫瘤血管。

在腫瘤組織中還存在另一種血管生成形式——血管生成擬態[7]，腫瘤細胞在外部刺激下可以形成類似于內皮細胞的管狀結構，紅細胞存在于這些管狀結構的管腔中。這些管狀組織可以附著在內皮血管上形成完整的血管網絡。血管生成擬態可以加速腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。而腫瘤新生血管可以抑制酸性代謝物的積累，促進腫瘤細胞的生長。它也會影響腫瘤微環境，使得腫瘤細胞從原發位置沿著新生血管壁轉移，并在恰當的位置生長形成新的腫瘤 。

腫瘤新生血管形成可以抑制DC的成熟，抑制免疫細胞的募集以及抑制細胞毒性 T 細胞活性，引起腫瘤免疫抑制。此外，腫瘤新生血管發育不成熟，壁細胞黏附不足會導致腫瘤血管通透性過高、灌注不良、缺氧。

實體瘤中缺氧的增加會進加速腫瘤的生長和轉移。腫瘤微環境進而產生大量促進腫瘤血管生成的因子，促進惡性腫瘤的生長。缺氧的腫瘤細胞會分泌血管生成分子，包括生長因子、細胞因子、生物活性脂質等，這些分子與相鄰血管內皮細胞上的受體結合，促進新生血管的形成。其中最具代表性的為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，它通過高度促有絲分裂作用促進腫瘤內的血管生成。當血管芽前緣的VEGFA達到最大濃度水平時，就可以與血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)結合，誘導內皮尖端細胞的遷移。VEGFR一旦被激活，就會進一步激活一系列影響細胞增殖和存活、細胞骨架重排和血管通透性的下游通路。此外，激活的內皮細胞釋放的基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotinase，MMP)會降解內皮基底膜和細胞外基質，促進血管生成生長因子的分泌。此后，成纖維細胞由于表型變化而表現出更高的增殖活性，并通過產生MMPs 和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)來刺激血管生成和腫瘤轉移[8]。

總的來說，血管生成過程包括基底膜和細胞外基質的破壞、內皮細胞的增殖和遷移、新血管的萌發以及血管成熟。促血管生成因子和抗血管生成因子的存在使血管生成保持平衡，而這種平衡的打破開啟了腫瘤血管生成開關，從而促使了腫瘤細胞的生長和轉移。值得注意的是，腫瘤血管生成不僅由腫瘤細胞介導，腫瘤基質中的免疫細胞也發揮了一定的作用。

2 免疫細胞對腫瘤血管生成的調節

2.1 先天免疫細胞對腫瘤血管生成的調節腫瘤微環境具有低氧和酸性的性質，在這種環境下，腫瘤細胞可以招募一定數量的先天免疫細胞，其中最具代表性的是腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)、中性粒細胞(neutrophils)、髓系免疫抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)。

2.1.1腫瘤相關巨噬細胞 TAMs是最突出的髓系細胞群之一，占腫瘤內細胞總數的0.30，并與腫瘤血管密度增加有關。在腫瘤發生發展過程中，組織的巨噬細胞會遷移至缺氧和壞死的腫瘤區域，在那里它們轉變為TAM表型。在內源性小鼠乳腺病毒PYMT腫瘤模型的血管生成方面，TAMs顯示出了重要的功能性。TAMs可以促進腫瘤血管惡性生成，一般通過阻斷集落刺激因子1/集落刺激因子受體1(colony stimulating factor 1/colony stimulating factor receptor 1，CSF1/CSF1R)途徑或者使用氯屈膦酸鹽脂質體來使TAMs失活，從而延遲了血管生成開關，在一定程度上恢復了血管生成表型[9]。

表達血管生成素受體Tie 2的單核細胞(Tie2-expressing monocytes，TEM)是巨噬細胞的一個亞群，它通過分泌血管生成素-2(angiopoietin -2，Ang-2)與血管生成密切相關。在乳腺癌小鼠模型中，通過Tie2啟動子驅動的胸苷激酶或者抗體介導的Tie2配體和Ang-2的中和作用來抑制TEM的表達[10]。如果細胞中Tie2基因缺失，那么它的促血管生成能力也會因此喪失。由于Tie2在巨噬細胞中的抑制作用與腫瘤內皮細胞缺失Ang2的影響相似，所以Ang2-Tie2軸可以作為促進新生血管生成的關鍵信號節點。

2.1.2轉移相關巨噬細胞 大量研究已證明,TAMs參與腫瘤血管生成的每一步，但是對MAMs的獨特作用知之甚少。在小鼠模型和原代分離的人細胞中，發現表達VEGFR1的MAM亞群具有高度的血管生成性[11]。在腫瘤轉移過程中，MAM釋放的MMP-9維持了其血管生成。同時,與MMP-9一起，另一種VEGFR1下游效應因子CSF1的表達也是腫瘤轉移生長所必需的。

2.1.3腫瘤相關中性粒細胞 在腫瘤發展的早期階段，中性粒細胞在促進血管生成中起著關鍵作用。在皮下注射的裸鼠中，轉染過表達趨化因子配體6(chemokine ligand 6，CXCL6)的人源黑色素瘤的中性粒細胞浸潤率是其對照組的10倍，并且觀察到該組血管生成數的增加[12]。中性粒細胞能夠釋放MMP-9來激活內皮細胞生長信號，促進血管生成。該細胞還分泌髓系過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，這對于巨噬細胞的募集和血小板的活化很重要。此外，中性粒細胞的減少可以顯著抑制血管內皮生長因子和其受體之間的聯系。

2.1.4髓系免疫抑制細胞 髓系免疫抑制細胞是異質性髓樣細胞，可分為髓系祖細胞和未成熟髓系細胞。據文獻報導，轉化生長因子β (transforming growth factor-beta，TGF-β)信號通路與腫瘤細胞運動、侵襲和轉移有關[13]。而MDSC可以產生大量的MMPs和TGF-β1，通過調節腫瘤血管化和腫瘤細胞的侵襲能力來對其進展和轉移產生深遠的影響。另外，依賴信號轉導和轉錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription，STAT3)信號，由MDSC產生的熊蜂肽8(bombina variegata peptide 8，Bv8)也可以促進血管生成[14]。

2.2 獲得性免疫細胞(T/B細胞)對于腫瘤血管的調節調節腫瘤血管生成的細胞不只有先天免疫細胞，獲得性免疫細胞也有這種作用。一方面，與髓系細胞一樣，B細胞可以通過產生促血管生成因子直接促進血管生成；或以免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)依賴的方式，使巨噬細胞極化為輔助性T淋巴細胞2(T helper 2 cell，Th2)免疫抑制和促血管生成表型而間接促進血管生成[15]。

另一方面，T細胞可以負向或正向控制腫瘤血管生成，例如CD8+細胞毒性T細胞和CD4 Th1細胞共同作用產生干擾素-γ(interferon gamma ,IFN-γ)，抑制血管內皮細胞的增殖；相反的，調節性T細胞抑制IFN-γ的表達，分泌血管內皮生長因子[16]。

3 免疫細胞對腫瘤淋巴管生成的調節

淋巴管是從組織到淋巴結再回到血液循環的通道。淋巴脈管系統作為非造血腫瘤基質的一部分，是抗腫瘤免疫反應的活性屏障。淋巴內皮細胞是接觸抗原的第一批細胞，且它含有相應的細胞因子和免疫細胞。

Tab 1 Mechanism of immune cells regulating tumor angiogenesis

3.1 先天免疫細胞對腫瘤淋巴管的調節在腫瘤浸潤性免疫細胞中，TAMs在促進腫瘤淋巴血管生成和轉移擴散中起重要作用；且腫瘤淋巴管生成與預后不良相關。

3.1.1腫瘤相關巨噬細胞 基于文獻研究，在腫瘤中，巨噬細胞的減少可以抑制腫瘤淋巴管的形成，證明TAMs參與了腫瘤淋巴管的生成。Bieniasz-krzywiec等[17]研究者從TAM亞群中發現了其中表達最高的腎小球足突細胞膜黏蛋白(podoplanin，PDPN)，表達PDPN的巨噬細胞會刺激淋巴局部基質重塑，促進血管生長和淋巴侵襲。Weichand等[18]研究者發現CD11bhiCD206+TAMs浸潤性小鼠乳腺腫瘤中鞘氨-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate，S1P)和S1P受體1(S1P receptor 1，S1pr1)的缺失可抑制肺轉移和腫瘤淋巴管生成。

TAMs通過表達VEGFC和VEGFD來促進淋巴管生成。其中VEGFC的產生會受到PEG2或CD4+T細胞的影響，同時阻斷COX-2、IFN-γ或白介素17(interleukin-17，IL-17)可以抑制巨噬細胞的VEGFC的表達[19]。在這過程中癌細胞以高度特異性的方式產生IL-1α來激活由巨噬細胞衍生的淋巴管生成。除了釋放淋巴管生長因子外，TAMs還可以產生有助于基質重塑和激活的相關生長因子酶，如MMPs和纖溶酶(plasmin)，間接調節淋巴管的生成[20]。

3.1.2表達Tie2的巨噬細胞 一項針對乳腺癌患者的研究表明，TEM與腫瘤中的淋巴管有關，但是與瘤周組織中的淋巴管無關。重要的是，腫瘤內的TEM表達人淋巴內皮透明質酸受體-1(human lymphatic endothelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1)、PDPN和VEGFR3，這些都是一些典型的淋巴生成標志物，而非腫瘤組織中的則不表達，這說明細胞表型轉換會受到腫瘤微環境的影響[21]。在體外，分離的TEM具有促血管生成和促淋巴管生成的功能，并且高水平地表達VEGFA、VEGFC和VEGFD。如果阻斷VEGFR和Tie2，那么就可以削弱其淋巴血管生成能力。淋巴管近端的巨噬細胞不僅為淋巴管的生成提供支撐，而且還促使了癌細胞發生內滲。

3.2 獲得性免疫細胞(T細胞)對于腫瘤淋巴管的調節近期有研究發現腫瘤淋巴管的生成可以促進黑色素瘤中T細胞的浸潤[22]；Bordry等[23]也發現淋巴管在腫瘤部位和淋巴結中發揮多重作用，促進T細胞浸潤和適應性免疫抑制；相反地，抑制Th1、Th2或Th17細胞因子可增加VEGFA和VEGFC的表達，從而促進淋巴管的生成。從機制上講，T細胞的缺失可以誘導巨噬細胞中缺氧誘導因子1α (hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)的表達，進而提高淋巴管內皮生長因子的水平。

但是，T細胞類獲得性免疫細胞在調節腫瘤淋巴管生成和淋巴轉移擴散中的作用沒有被研究過，所以需要研究者們根據腫瘤生物學對T細胞介導的免疫治療進行更為深入的探索。

4 免疫細胞介導抗血管生成治療中腫瘤抵抗性的形成

4.1 先天免疫細胞對抗血管生成治療的影響先天免疫細胞不僅可以促進血管生成，而且通過刺激血管內皮生長因子非依賴性途徑來保護腫瘤不受抗血管生成療法的影響。除了VEGF，TAMs和TANs還分泌其他促血管生成因子，如MMP9和Ang2，增強對VEGF的抑制作用[24](Fig 1)。具體來說，免疫細胞在經抗血管生成治療后復發的幾種腫瘤中富集，通過分泌血管生成介質來促血管生成。而TANs信號的增強是由CX3CR1+Ly6C+單核細胞所導致的，這些單核細胞由于CX3CL1對抗血管生成治療的應答而被募集到腫瘤部位[25]。

Tab 2 Mechanism of immune cells regulating tumor lymphangiogenesis

Fig 1 VEGF/VEGFR signaling controls angiogenesis and tumor immunityVEGF facilitated several aspects of vessel formation and also promoted immunosuppression by acting on different cell types.In endothelial cells,VEGF inhibited the expression of the T cell adhesion molecules VCAM and ICAM and induced expression of the PD-1 ligands PD-L1 and PD-L2 that interacted with PD-1 on T cells,resulting in reduced T cell proliferation and effector function.VEGF also directly impaired DC maturation and induced PD-L1 expression on mature DCs.It inhibited the proliferation and effector function of CTLs but induced the proliferation of Tregs.Tregs in turn recruited MDSCs and TAMs,which produced ROS,iNOS,and Arg to suppress T cell proliferation,viability,and activity.In contrast,inhibition of VEGF signaling enabled enhanced T cell infiltration due to vessel normalization accompanied with an increase of ICAM and VCAM,which enhanced DC maturation and thus provided more intratumoral effector T cells.VEGF/VEGFR blockade also increased the presence of Th1/M1-polarized myeloid cells.

此外,VEGFR2阻斷的轉基因小鼠的胰腺腫瘤中的TEMs可以促血管生成，這可以通過雙重ANG2/VEGFR2抑制劑來抑制[26]。CXCR4+TEMs參與了乳腺腫瘤的血管重建過程，該腫瘤未接受血管破壞劑康布他汀A4磷酸鹽(combretastatin A4 phosphate，CA4P)的治療。CA4P阻塞腫瘤血管而誘導瘤內缺氧，增強了HIF誘導的CXCL12表達和CXCR4+TEMs的浸潤[27]。CA4P和CXCR4抑制劑的聯合應用可以阻斷腫瘤壞死因子的積累，促使CA4P誘導的腫瘤壞死，減緩腫瘤的生長。所以治療產生的缺氧情況可以增加Ang2和CXCL12的表達和分泌，進而影響腫瘤中TEMs的血管生成活性。

4.2 獲得性免疫細胞對抗血管生成治療的影響在復發情況下，腫瘤可以上調其中的負性免疫檢查點調節因子——PD-L1的表達。PD-L1在活化的T細胞表面結合PD-1，促使T細胞發生衰竭，從而觸發免疫抑制。抗PD-L1免疫療法與抗血管生成療法相結合具有協同增效的效果，因為免疫療法可以填補抗血管生成療法的漏洞，而由抗血管生成療法引發的血管正常化可以增加淋巴細胞的浸潤和活化。令人驚訝的是，在成功治療腫瘤的案例中，抗血管生成聯合免疫的療法誘導了高內皮微靜脈(high endothelial venule，HEV)樣結構的形成，這種結構在次級淋巴器官中存在，并特異性促進淋巴細胞的轉運[28]。腫瘤內的HEVs顯著增強了細胞毒性T細胞的浸潤和活性，從而殺傷腫瘤細胞，改善腫瘤患者的病情[29]。總的來說，免疫檢查點抑制劑可以敏化和增強阻斷VEGF信號的能力；而抗血管生成治療可以通過促使血管變化來改善免疫治療。同時，Tian等[30]的研究成果也進一步支持了這個觀點，他們證明了腫瘤內T淋巴細胞的浸潤促進了血管的正常化；此外，正常的脈管系統具有增強T細胞浸潤的能力。CD4和CD8 T細胞缺乏的小鼠的腫瘤中存在較多的異常腫瘤血管和缺氧區域。細胞毒性T細胞經免疫檢查點或過繼Th1轉移療法活化后，可以誘導血管正常化，減少瘤內缺氧，抑制腫瘤轉移。

5 總結與展望

雖然腫瘤細胞是血管生成和淋巴管生成的重要來源，但是無論在原發部位，還是在轉移部位，被招募的白細胞、TAMs和TANs等在腫瘤血行轉移過程中也起著關鍵作用。一定程度上，腫瘤血管和淋巴管的生長是由免疫系統調節的，浸潤的先天免疫細胞和獲得性免疫細胞既提供免疫抑制信號，又提供各種血管生成信號。免疫細胞是腫瘤血管和淋巴管生成的關鍵控制者，所以靶向免疫細胞是一種有前途的腫瘤治療方法，它可以在細胞和分子水平上實現。本文基于這些機制，分析了免疫療法和抗血管生成之間的聯系，以及它們之間的協同增效關系。

臨床試驗已經將抗血管生成和免疫療法以及各種增強T細胞浸潤和活化的方法結合起來，這將有助于協調癌癥中免疫系統和血管系統之間的相互作用。

而針對于未來的研究，首先可以進行免疫細胞的系統性耗竭研究。但是這種方法存在極大的爭議，因為長期缺乏這些細胞會導致機體對細菌感染的敏感性增強，影響整個免疫系統功能。其次可以阻止特定的促血管生成免疫細胞進入腫瘤部位，例如破壞Ang2/Tie2軸可以阻斷腫瘤對血管生成性免疫細胞的浸潤。最后，免疫細胞的促血管生成活性基于但不限于釋放常見的血管生成因子，根據腫瘤類型和相對應的器官，腫瘤特異性微環境可以誘導其中不同的促血管生成表達。因此，迫切需要探索新的血管生成因子并驗證其在特定類型癌癥中的靶向性。

腫瘤療法從抗血管生成到免疫療法，從單一免疫細胞治療到多種免疫細胞聯合治療，未來的研究將在腫瘤血管機制的基礎上，進一步挖掘腫瘤與免疫細胞之間的相互作用，為新一代靶向腫瘤藥物的開發提供依據和思路。