耳聾左慈丸對H2O2損傷小鼠耳蝸基底膜miR-34a的作用及機制

楚 敏，閻希芮，龔永昌，劉 晴，施建蓉，董 楊

(上海中醫藥大學1.教學實驗中心、2.基礎醫學院，上海 201203)

老年性聾(presbycusis)又稱為年齡相關性聽力損失(age-related hearing loss，ARHL)，是指隨著年齡的增長而引起聽覺器官衰老和退變所造成的聽力損失，是一種復雜的神經退行性疾病。老年性聾的發病機制復雜，目前仍然不十分清楚，研究認為，該病與氧化應激、細胞凋亡、線粒體功能障礙等有關[1]。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)與老年性聾的關系得到越來越多的關注[2]。miRNA是一類非蛋白質編碼性RNA分子，可引起mRNA 降解或抑制蛋白質翻譯參與細胞的生理和病理過程。Zhang等[3]在C57BL/6J小鼠和CBA/J小鼠模型上檢測參與老年性聾發病過程中耳蝸螺旋器退化的miRNA，發現促凋亡miRNA(miR-29和miR-34家族)的上調以及促增殖、分化miRNA(miR-181和miR-183家族)的下調。ROS引起的miRNA表達變化可能引起耳蝸螺旋器的退化，參與老年性聾的發病機制[4]。

沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是miR-34a的靶基因，參與調節氧化應激引起的細胞凋亡，又可以對自噬作用進行調控[5]。SIRT1可以介導自噬相關蛋白Atg9的乙?；饔?，調節內質網應激下的自噬。微管相關輕鏈蛋白3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是一種自噬標記物，其C端可被自噬相關蛋白Atg4分割成 LC3-Ⅰ，分布于胞質。在自噬體形成之后，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合，生成LC3-Ⅱ，并穩定的固定在自噬體內外膜，直到形成自噬溶酶體。因此，LC3-Ⅱ 蛋白的表達可以在一定程度上反映自噬細胞內自噬體的多少。選擇性自噬接頭蛋白(p62/sequestosome 1，SQSTM1)是連接 LC3-Ⅱ 蛋白與待降解泛素化底物的重要橋梁。當某些 Atg 基因突變、缺失或者自噬溶酶體形成受阻時，p62蛋白會出現明顯堆積[6]。

耳聾左慈丸(Erlong Zuoci Wan，ELZC)(《中國藥典》2015版)為治療耳聾、耳鳴的經典古方，由熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、丹皮、柴胡、磁石八味藥組成，功效滋腎平肝，主治肝腎陰虛的耳鳴耳聾、頭暈目?！，F代藥理學研究發現，耳聾左慈丸對耳鳴、藥物性聾和老年性聾均有一定的治療作用[7]。課題組前期研究發現，耳聾左慈丸可以減輕 C57BL/6J 早發性老年性聾小鼠年齡相關的聽力損失和耳蝸病理損傷[8]。耳蝸毛細胞暴露于過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)會產生氧化損傷反應，并表現出衰老相關β-半乳糖苷酶活性增高的現象，常用于老年性聾離體培養模型的建立[9]。本研究擬在小鼠耳蝸基底膜離體培養模型上，進一步觀察耳聾左慈丸對H2O2損傷后miR-34a及其下游蛋白的作用，探討耳聾左慈丸防治老年性聾的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級C57BL/6J小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK(滬)2017-0005，4 d齡。

1.2 藥物耳聾左慈丸由八味中藥組成：熟地(批號：200307)、山茱萸(制)(批號：191231)、山藥(批號：200218)、茯苓(批號：200121)、澤瀉(批號：200120)、牡丹皮(批號：190810)、柴胡(批號：200205)、磁石(煅)(批號：190527)，購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。按照前期研究[7]，先將耳聾左慈丸各組分按照8 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1的比例配伍組成，稱取相應中藥，8倍量雙蒸水浸泡2 h，武火煮沸后轉文火煎煮30 min，取藥液；再加雙蒸水武火煮沸后轉文火煎煮30 min，取藥液。將兩次藥液合并，濃縮至所需生藥濃度。按體積比2 ∶3加入無水乙醇，4 ℃靜置 24 h后，2000 rpm 離心 15 min 取上清。蒸發濃縮，制備成 0.3 kg·L-1(按生藥濃度計算)的母液，經 0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存。使用時用培養液稀釋至合適濃度。

1.3 試劑H2O2(美國Sigma公司)；牛血清白蛋白(美國Sigma公司)；BME培養基(美國Sigma 公司)；Hanks液(美國Thermo公司)；miRNeasy mini kit試劑盒(德國 QIAGEN 公司)；染料法 Hairpin-it miRNAs定量和u6校準 qRT-PCR 試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；TUNEL檢測試劑盒(美國Promega公司)；phalloidin -TRITC(美國Sigma 公司)；抗體LC3-Ⅱ、p62、SIRT1和羊抗兔 Alexa Fluor488，均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.4 儀器二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司)；LSM880共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)；LightCycler 96 SW熒光定量PCR儀(美國 Roche公司)；解剖顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.5 小鼠耳蝸組織取材及培養將出生4 d的C57BL/6J小鼠用75%酒精進行全身皮膚表面消毒，在解剖顯微鏡下取出耳蝸，放入盛有Hanks液的培養皿中，撥開耳蝸殼，將基底膜組織與蝸軸分離，去掉螺旋韌帶、血管紋等其他結構，分離出整個基底膜，放入含無血清培養液的35 mm培養皿中，移到膠原凝膠滴的表面，鋪放平整。在細胞培養箱(37 ℃，5%CO2)中培養，隔日更換無血清培養液。

1.6 實驗分組和給藥小鼠耳蝸基底膜離體培養24 h后，隨機分為5組：對照組、H2O2模型組和耳聾左慈丸組(5 mg·L-1、10 mg·L-1和50 mg·L-1)，每組14只。耳聾左慈丸組先以藥物預處理24 h，對照組和模型組更換無血清培養液，24 h后模型組和耳聾左慈丸組加入0.3 mmol·L-1的H2O2繼續置于細胞培養箱孵育4 h，終止培養。

1.7 Real-time qPCR法檢測miR-34a表達終止培養后，收集基底膜組織，每組6只動物，設3個復孔。提取其miRNA(具體步驟參照說明書進行)。引物設計與合成由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。mmu-mir-34a-5p基因引物序列：TCTGTCTCTCTTGGCAGTGTCTTA。miRNA逆轉錄和qPCR選用U6 snRNA作為內參。整個擴增反應體系參照試劑盒說明書進行。反應條件：95 ℃，3 min預變性；95 ℃，12 s變性；60 ℃，40 s，循環40次。實驗結果采用公式 2-△△Ct計算miR-34a的相對表達量。

1.8 免疫熒光組化法檢測蛋白表達終止培養后，加入4% 多聚甲醛固定液固定1 h，用細鑷刮脫帶有基底膜的膠滴，0.01 mol·L-1PBS清洗3次，10% 山羊血清封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；0.01 mol·L-1PBS清洗3次，加入Alexa Fluor 488標記的羊抗兔二抗(1 ∶400)，避光孵育1 h；0.01 M PBS清洗3次，加入phalloidin-TRITC(1 ∶200)，避光孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS清洗3次。滴加50% 甘油PBS封固于玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察。免疫熒光圖片采用ZEN 2.3 lite軟件進行熒光半定量分析，每組4個耳蝸基底膜組織。

1.9 TUNEL法檢測細胞凋亡終止培養后，加入4% 多聚甲醛固定液固定30 min，用細鑷刮脫帶有基底膜的膠滴，0.01 mol·L-1PBS清洗3次，按照說明書，使用 TUNEL檢測試劑盒，注意避光。然后用0.01 mol·L-1PBS清洗3次，加入phalloidin -TRITC(1 ∶200)，避光孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS清洗3次。滴加50% 甘油PBS封固于玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察，每組4個耳蝸基底膜組織。

2 結果

2.1 耳聾左慈丸對H2O2損傷小鼠耳蝸基底膜miR-34a表達的影響Real-time qPCR結果顯示，與對照組相比，H2O2模型組miR-34a表達明顯升高(P<0.01)，耳聾左慈丸組miR-34a表達與模型組比較明顯下降(P<0.01)。提示耳聾左慈丸可以抑制H2O2致小鼠耳蝸基底膜損傷后miR-34a的表達增高(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ELZC on miR-34a expression in H2O2damaged cochlear cultures **P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs model group

2.2 耳聾左慈丸對H2O2損傷后毛細胞SIRT1蛋白表達的影響結果如Fig 2所示，對照組耳蝸毛細胞排列整齊，無缺失；0.3 mmol·L-1的H2O2作用4 h后外毛細胞大量缺失，內毛細胞損傷較?。欢@左慈丸給藥后，隨著濃度的增加，毛細胞丟失和損傷明顯減輕。與對照組相比，模型組耳蝸毛細胞SIRT1蛋白熒光強度明顯降低(P<0.01)，耳聾左慈丸組SIRT1蛋白表達與模型組比較有增強趨勢，50 mg·L-1耳聾左慈丸組SIRT1蛋白表達與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 耳聾左慈丸對H2O2損傷后毛細胞自噬相關蛋白的影響結果顯示，與對照組相比，模型組毛細胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)；耳聾左慈丸組與模型組相比，LC3-Ⅱ和p62蛋白熒光表達明顯降低(P<0.01，P<0.05)。以上結果提示，H2O2可以引起耳蝸基底膜毛細胞自噬體的堆積，損傷自噬流，而耳聾左慈丸有減少自噬體堆積，減輕自噬流損傷的作用(Fig 3)。

2.4 耳聾左慈丸對H2O2損傷后毛細胞凋亡的影響結果如Fig 4所示，對照組基底膜毛細胞幾乎沒有 TUNEL陽性細胞出現，而H2O2模型組TUNEL陽性細胞數明顯增多；耳聾左慈丸組TUNEL陽性細胞數與模型組相比明顯降低。以上結果提示，H2O2可以誘導小鼠耳蝸基底膜毛細胞的凋亡，耳聾左慈丸具有抑制細胞凋亡的作用。

Fig 2 Effect of ELZC on SIRT1 expression in A:Immunofluorescence staining of SIRT1，bar=10 μm；B:Densitometry analysis of SIRT1.**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs model group

Fig 3 Effects of ELZC on LC3-Ⅱ and p62 expression in H2O2 damaged cochlear cultures n=4)A:Immunofluorescence staining and densitometry analysis of LC3-Ⅱ；B:Immunofluorescence staining and densitometry analysis of p62,bar=10 μm.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group

Fig 4 Effect of ELZC on apoptosis in H2O2 damaged cochlear cultures (n=4).bar=10 μm

3 討論

miRNA是一類非編碼微小RNA分子，通過特異性結合靶基因mRNA的3′端非翻譯區，引起mRNA降解或蛋白質翻譯抑制[10]。miRNA 在老年性聾的發病機制中也可能具有重要作用。miR-34a是誘導衰老、細胞周期阻滯和凋亡的關鍵因子。在C57BL/6J早發性老年聾小鼠耳蝸中，miR-34a表達增加，抑制自噬相關蛋白ATG9A的表達，損傷自噬流，引起細胞死亡[11]。還有研究發現，老年性聾患者血漿中miR-34a水平明顯增高，這些都提示，miR-34a在老年性聾的發病機制中有重要作用[12]。

SIRT1是一種 NAD+ 依賴性去乙?；?，在代謝和衰老過程的調節中發揮重要作用。越來越多的研究將SIRT1作為治療年齡相關性疾病的作用靶點。SIRT1是miR-34a的靶基因，miR-34a升高可以通過作用于NAMPT降低SIRT1的活性[13]。Xiong等[14]發現，調控miR-34a/SIRT1信號通路，可以協調線粒體自噬和線粒體生物合成，保護耳蝸毛細胞，延緩年齡相關性聽力損失。本研究發現，耳聾左慈丸可以降低H2O2誘導的耳蝸基底膜miR-34a表達的升高，并上調SIRT1蛋白表達，提示耳聾左慈丸可能通過miR-34a/SIRT1通路抑制耳蝸基底膜的氧化損傷。

自噬和凋亡是調控細胞死亡的兩個重要途徑[15]。自噬是細胞在生理或病理因子作用下，通過溶酶體途徑對錯誤折疊的蛋白質和功能受損的細胞器進行有效的識別和降解[16]。因此，自噬被認為是細胞除凋亡和壞死之外的第三種死亡方式。有研究發現，氧化應激和慢性炎癥可以誘發線粒體受損和蛋白質表達異常，此時自噬水平的早期上調可以起到一定的清除作用，而自噬流一旦出現阻滯現象，就會加速聚集大量無功能的線粒體和蛋白分子，出現凋亡、自噬或兩種細胞死亡途徑共存的現象，引發耳蝸毛細胞毒性反應[17]。SIRT1可以與ATG5、ATG7和LC3作用，并去乙?；@些蛋白，表明SIRT1也可以直接參與自噬調節[18]。本研究發現，H2O2可以引起耳蝸基底膜毛細胞LC3-Ⅱ 和p62蛋白表達增高，提示自噬體堆積、自噬流阻滯，耳聾左慈丸可降低LC3-Ⅱ 和p62蛋白表達，f具有恢復自噬流的作用。

綜上所述，耳聾左慈丸可能通過作用于miR-34a，調節SIRT1蛋白，進而影響自噬流，抑制細胞凋亡，對H2O2致小鼠耳蝸基底膜毛細胞損傷起到保護作用。

(致謝：本研究在上海中醫藥大學基礎醫學院聽覺實驗室完成，在此致以衷心的感謝！)