蘆薈大黃素衍生物AE-YJ通過PI3K-Akt/NF-κB和MAPK/NF-κB途徑抑制LPS誘導RAW264.7細胞炎癥介質的釋放

郭 靜，尚 海，馬麗炎，高 源，李陵宇，鄒忠梅，宛 蕾

(1.貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽 貴州 550025；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193)

炎癥定義為免疫系統對微生物入侵或傷害的局部保護反應[1]。但值得注意的是，過度的炎癥會損害身體[2]。巨噬細胞作為重要的免疫細胞充當抵御入侵物(細菌、病毒和真菌)的第一道防線[3]。在炎癥過程中，巨噬細胞產生過量的炎癥介質[4]，例如PGE2、NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等，繼而引發一系列炎癥反應。炎癥與許多疾病相關，并且由于其復雜性很難被治愈[5]。

炎癥通過不同途徑起作用。NF-κB作為炎癥發生的一條重要途徑，是炎癥和抗炎的核心[6]。細胞外刺激(例如IL-1β和TNF-α)可觸發NF-κB途徑激活。NF-κB信號通路的起始端由信號分子結合膜受體(例如TLR4)進行信號傳導，激活IKK激酶。IKK是IκB的激酶，可以促進IκB的磷酸化，磷酸化的IκB被泛素化降解，使得NF-κB脫離出來從胞質入核，激活下游基因(例如iNOS和COX-2)的轉錄[7]。NF-κB的轉錄活性受細胞內級聯反應的調控，包括PI3K/Akt和MAPK途徑。PI3K/Akt途徑中，活化的Akt增加IKKα的磷酸化，激活NF-κB途徑[8]。MAPK稱為NF-κB的上游激活劑，可調控NF-κB途徑的轉錄激活[9]。MAPK信號通路本身也對炎癥因子的釋放起著重要的調節作用[10]。研究證明，MAPK抑制劑降低LPS誘導RAW264.7細胞中NF-κB的下游效應因子，例如iNOS和COX-2的蛋白表達[11]。總之，PI3K-Akt/NF-κB和MAPK/NF-κB途徑之間相對激活的微妙平衡似乎對于細胞存活和增殖基因的表達至關重要[12]。

蘆薈大黃素(aloe-emodin,AE)作為一種蒽醌類天然產物，主要來源于大黃、蘆薈、決明子等中藥，其具有出色的抗炎活性。已有研究表明，蘆薈大黃素可通過NF-κB[13]，MAPK[14]和PI3K/Akt[15]等多種途徑降低炎癥因子(例如TNF-α、IL-1β、IL-6)的產生發揮抗炎作用。然而，蘆薈大黃素的溶解度很差，在很大程度上影響了其生物利用度。因此，本研究設計合成帶親水哌嗪基團的蘆薈大黃素衍生物AE-YJ。在此基礎上，以LPS誘導RAW264.7細胞作為炎性細胞模型，檢測AE-YJ對LPS誘導RAW264.7細胞釋放炎癥介質的影響，通過蛋白質印跡分析和免疫熒光的方法進一步研究對PI3K/Akt、NF-κB和MAPK信號途徑的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株RAW264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(20042706，北京北納創聯生物技術研究院)。

1.2 藥品與試劑蘆薈大黃素(DL0007)，成都德思特生物技術有限公司；LPS(057M4013V)，美國Sigma公司；DMEM培養基(11965092)，美國Gibco公司；FBS(10099-141)，澳大利亞Gibco公司；ECL Western blot底物(P0018FS、BCA蛋白質檢測試劑盒(P0012S)、一氧化氮檢測試劑盒(S0021)，中國Beyotime公司；TNF-α ELISA試劑盒(430907)、IL-6 ELISA試劑盒(431307)，美國Biolegend公司；IL-1β ELISA試劑盒(1210122)，深圳達科為公司；PGE2 ELISA試劑盒(ADI-930-001)，美國ENZO公司；iNOS兔多克隆抗體(A18247，1 ∶1 000)、COX-2兔多克隆抗體(A1253，1 ∶1 000)、IκBα兔單克隆抗體(A19714，1 ∶1 000)、p-IκBα兔多克隆抗體(AP0614，1 ∶1000)、NF-κB p65兔單克隆抗體(A19653，1 ∶1 000)、Akt 兔單克隆抗體(A17909，1 ∶1 000)、p-Akt 兔單克隆抗體(AP1208，1 ∶1 000)、ERK1/2鼠單克隆抗體(A10613，1 ∶1 000)、p-ERK1/2鼠單克隆抗體(AP0485，1 ∶1 000)、p38 兔單克隆抗體(A4771，1 ∶1 000)、p-p38 兔多克隆抗體(AP0057，1 ∶1 000)、JNK1/JNK2/JNK3兔單克隆抗體(A4867，1 ∶1 000)、p-JNK 兔單克隆抗體(AP0613，1 ∶1 000)、組蛋白H3多克隆抗體(A2348，1 ∶1 000)、GAPDH兔單克隆抗體(AC033，1 ∶1 000)、羊抗兔IgG辣根過氧化物酶二抗(AS014，1 ∶10 000)、羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶二抗(AS003，1 ∶10 000)、Alexa Fluor 488羊抗兔IgG辣根過氧化物酶二抗(AS053，1 ∶500)，武漢ABclonal公司。

1.3 AE-YJ的結構本實驗室合成了AE-YJ，見Fig 1。

Fig 1 Chemical structures of AE and AE-YJ

1.4 細胞培養RAW264.7細胞培養使用含10%熱滅活的FBS含青霉素G(100 kU·L-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)的DMEM培養基，在5% CO2和95%空氣的潮濕環境中培養。RAW264.7細胞每隔3 d進行傳代培養。將細胞用不同濃度的AE-YJ培養，并用LPS(10 μg·L-1)刺激指定的時間。在DMSO中制備AE-YJ的儲備溶液，實驗中所用AE-YJ為培養基稀釋至指定濃度，DMSO的最終濃度小于0.5%。

1.5 小鼠腹膜原發性巨噬細胞的提取實驗動物為雄性Balb/c小鼠，(18-22)g，SPF級，購自北京維通利華，SYXK(京)2016-0006，飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所實驗動物中心(SPF級)。所有動物實驗均得到中國醫學科學院藥用植物研究所動物倫理委員會的批準。

1.6 AE-YJ對RAW264.7細胞活力的影響用不同濃度的AE-YJ(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol·L-1)處理RAW264.7細胞(2.0×109個·L-1)24 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結晶物充分溶解。在酶標儀492 nm處讀取吸光度。

1.7 NO測定將RAW264.7細胞以2.0×109個·L-1的密度接種到96孔板中，然后用10 μg·L-1LPS和AE-YJ(1.5625、3.125、6.25、12.5、25 μmol·L-1)處理24 h。收集細胞培養上清，按NO檢測試劑盒操作說明檢測NO含量。

1.8 NO自由基的清除根據文獻報道的方法[16]測定AE-YJ對一氧化氮自由基的影響。將75 μL硝普鈉(60 mmol·L-1SNP溶于PBS)溶液與75 μL不同濃度的AE-YJ在25 ℃避光孵育5 h。然后將100 μL Griess試劑添加到包含混合物的孔中，540 nm測亞硝酸鹽水平。

1.9 IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2測定RAW264.7細胞(2.0×109個·L-1)接種至96孔板中，并用不同濃度(3.125、6.25、12.5 μmol·L-1)的AE或AE-YJ和LPS(10 μg·L-1)孵育24 h。收集細胞培養上清液后，使用LEGEND MAXTM小鼠ELISA試劑盒測定IL-6、TNF-α的濃度。用小鼠IL-1β ELISA試劑盒檢測IL-1β含量。用PGE2高靈敏度ELISA試劑盒對樣品中PGE2濃度進行了定量。

1.10 細胞核和細胞漿蛋白的制備RAW264.7細胞(2.0×109個·L-1)接種至6孔板中，用不同濃度(3.125、6.25、12.5 μmol·L-1)的AE-YJ處理細胞24 h，100 μg·L-1LPS刺激30 min后，按細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒說明分別制備細胞核蛋白和細胞質蛋白，然后進行Western印跡分析。

1.11 總mRNA提取和定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)RAW264.7細胞接種在6孔板，LPS(10 μg·L-1)和AE-YJ共同處理24 h后，使用TRIzol從細胞樣品中分離出總RNA。用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ將總RNA(2 μg)反轉錄成cDNA 20 μL。q-PCR在PIKORed 96實時PCR上進行。用于RT-PCR分析的引物序列如下。COX-2 sense-ATTCCAAACCAGCAGACTCATA,antisense-CTTGAGTTTG AAGTGGTAACCG,IL-6 sense-CTCCCAACAGACCT GTCTATAC,antisense-CCATTGCACAACTTTTCTCA;IL-1β sense-TCTCGCAGCAGCAACATCAACAAGAGC，antisense-GGAAGGTCCAAGGGAAAGACACAGGT;GAPDH sense-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA TT,antisense-GTCTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG循環擴增條件如下隨后：95 ℃初始變性30 s，95 ℃持續變性5 s和55 ℃持續退火30 s，72 ℃持續30 s充分延伸，采集熒光。完成45個PCR擴增周期后，進行溶解曲線分析。COX-2、IL-1β、IL-6 mRNA水平歸一化為GAPDH。

1.12 蛋白質印跡分析RAW264.7細胞(2.0×109個·L-1)接種至6孔板中并生長直到85%-95%匯合度。裂解細胞后在4 ℃下離心15 min，BCA試劑盒測定蛋白質濃度后，煮沸10 min使其完全變性。用4%-20%梯度分離膠電泳分離后再轉移至PVDF膜。室溫下用封閉液封閉30 min，然后將膜與特異性一抗在4 ℃孵育過夜。洗膜3次后孵育對應二抗1 h。洗膜3次后在ChemDocTMXRS +成像系統(美國Bio-Rad)中獲得蛋白條帶。將GAPDH和H3用作過程控制的內標。用Image Lab軟件進行印跡密度測定。

1.13 免疫熒光檢測取對數生長期RAW264.7細胞(5.0×109個·L-1)，取500 μL接種至24孔板，用不同濃度的AE-YJ(3.125、6.25、12.5 μmol·L-1)處理24 h。在100 μg·L-1LPS刺激30 min后，將細胞用4%多聚甲醛固定15 min。用0.5% Triton X-100處理10 min，然后用免疫熒光封閉液封閉1 h，用p65抗體在4 ℃孵育過夜。將細胞與Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG避光在室溫下孵育1 h。在黑暗中，用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片，使用掃描電子顯微鏡(Ex:495 nm，Em:519 nm，Inspect，美國FEI)掃描全片。使用Caseviewer軟件進行分析。

2 結果

2.1 AE-YJ減少LPS誘導的RAW264.7細胞中NO的產生MTT結果顯示，AE-YJ在0-25 μmol·L-1的濃度下對細胞活力無明顯影響(Fig 2A)。因此，在下述實驗中，AE-YJ的濃度不超過25 μmol·L-1。Griess實驗顯示，LPS誘導，RAW264.7細胞中的NO明顯增加(P<0.01)。AE-YJ明顯抑制LPS誘導產生NO(P<0.01)(Fig 2B)，6.25 μmol·L-1劑量AE-YJ抑制NO作用明顯強于AE(P<0.01)。AE和AE-YJ抑制LPS刺激RAW264.7細胞中NO釋放的IC50分別為7.091 μmol·L-1和5.725 μmol·L-1。在小鼠腹膜原發性巨噬細胞中也得到了類似結果，AE-YJ和AE抑制LPS刺激NO釋放的IC50分別為5.332 μmol·L-1和3.191 μmol·L-1(Fig 2C)。因此，AE-YJ抑制LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO并不是由細胞毒作用導致的。

2.2 AE-YJ對NO自由基無直接清除作用將不同濃度的AE-YJ(0-25 μmol·L-1)與SNP避光25 ℃孵育5 h。結果顯示，AE-YJ未減少SNP溶液中NO自由基釋放(Fig 3)。同時，AE也得到了相似的實驗結果。因此，AE-YJ無直接清除NO自由基的作用。

2.3 AE-YJ減少LPS誘導的RAW264.7細胞促炎細胞因子的釋放使用ELISA試劑盒測定培養上清中PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。結果顯示(Fig 4)，LPS模型組的細胞上清液中PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度明顯增加(P<0.01)。不同濃度的AE-YJ對LPS誘導的RAW264.7細胞中PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放具有明顯的抑制作用(P<0.01)。同等劑量的AE-YJ抑制作用明顯強于AE(P<0.01)。因此，AE-YJ可明顯抑制RAW264.7細胞中炎癥介質(如PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6)的釋放，且抑制作用強于AE。

Fig 2 Effect of AE and AE-YJ on NO release ##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group；△△P<0.01 vs AE group.

2.4 AE-YJ減少LPS誘導的RAW264.7細胞中COX-2、IL-1β、IL-6 mRNA表達Fig 5所示，LPS(10 μg·L-1)模型組中IL-1β、IL-6和COX-2 mRNA的表達明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，不同濃度的AE-YJ處理RAW264.7細胞24 h后，IL-1β、IL-6和COX-2 mRNA的表達水平明顯降低(P<0.01)。與同等濃度處理的AE組相比，AE-YJ抑制IL-1β、IL-6和COX-2 mRNA表達的作用更強(P<0.01)。

Fig 3 Effects of AE-YJ on nitric oxide radicals n=3)##P<0.01 vs control group.

2.5 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中iNOS、COX-2的蛋白表達RAW264.7細胞用LPS(10 μg·L-1)和AE-YJ處理24 h，并通過蛋白印跡法分析NF-κB信號通路中iNOS、COX-2的表達。如Fig 6所示，LPS模型組iNOS和COX-2的蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組比較，AE-YJ處理后LPS刺激的RAW264.7細胞中iNOS和COX-2的表達明顯降低(P<0.01)。

2.6 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中NF-κB通路的激活LPS(100 μg·L-1)暴露促進了模型組中RAW264.7細胞中的IκBα蛋白降解(P<0.01)(Fig 7A，B)。與LPS模型組相比，AE高濃度處理可以阻礙IκBα蛋白降解(P<0.01)，AE-YJ可明顯抑制IκBα蛋白降解(P<0.01)，但AE-YJ還顯示出可以明顯增加IκBα蛋白表達水平(P<0.01)。為了研究AE-YJ對NF-κB p65核易位的影響，使用蛋白質印記分析和免疫熒光法檢查了 LPS刺激后p65在細胞質和細胞核的分布。如Fig 7(C，D，E，F)所示，LPS模型組RAW264.7細胞核中p65的含量明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，AE-YJ的處理明顯降低了p65蛋白在細胞核中含量(P<0.01)。免疫熒光結果進一步顯示(Fig 7G-I)，正常對照組中，p65蛋白在細胞核內幾乎無表達。LPS模型組RAW264.7細胞，p65在細胞核內的含量明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，AE-YJ明顯減少p65蛋白進入細胞核的量(P<0.01)。這些結果表明，AE-YJ抑制LPS刺激的巨噬細胞中轉錄因子NF-κB p65的核易位，并且能增加IκBα的蛋白表達。因此，AE-YJ抑制了RAW264.7細胞中LPS誘導的NF-κB信號通路的激活，這可能與增加IκBα的蛋白表達有關。

Fig 4 Effects of AE and AE-YJ on inflammatory mediators released by LPS stimulated RAW 264.7 cells n=3)##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group;△△P<0.01 vs AE group.

Fig 5 Effects of AE-YJ on mRNA expression of IL-1β,IL-6 and COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells ##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs LPS group;ΔΔP<0.01 vs AE group.

2.7 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中PI3K/Akt信號通路的激活如Fig 8，LPS誘導模型組RAW264.7細胞中磷酸化Akt的表達明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，3.125 μmol·L-1AE-YJ處理使磷酸化Akt的表達降低75%(P<0.01)，而相同濃度的AE僅使其降低30%(P<0.01)。6.25 μmol·L-1濃度下AE-YJ和AE分別使Akt的磷酸化表達降低85%(P<0.01)和65%(P<0.01)。12.5 μmol·L-1濃度下AE-YJ和AE分別使Akt的磷酸化表達降低93%(P<0.01)和90%(P<0.01)。這些結果表明，AE-YJ對Akt磷酸化的抑制作用強于AE。

Fig 6 Effects of AE-YJ on protein expression levels of iNOS,COX-2 in LPS stimulated RAW264.7 cells ##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs LPS group.

2.8 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中MAPK信號通路的激活結果如Fig 9所示。LPS模型組p-ERK、p-p38和p-JNK的蛋白表達明顯增加(P<0.01)，表明LPS誘導可以激活RAW264.7細胞MAPK途徑中的ERK、p38和JNK的磷酸化。與LPS模型組相比，AE-YJ處理后，LPS誘導的RAW264.7細胞中MAPK信號通路的p-ERK、p-p38和p-JNK的表達明顯減少(P<0.01)。結果表明AE-YJ的抗炎機制可能與抑制MAPK信號通路的激活有關。AE-YJ也可能是通過抑制MAPK信號通路中ERK、p38和JNK蛋白的激活，并間接影響NF-κB通路的活化，通過MAPK/NF-κB途徑發揮抗炎作用。

3 討論

許多研究已證明,AE在體內外具有多種藥理活性[10]，其抗炎作用尤為突出[17]。對AE的結構進行了修飾，設計引入含氮基團和哌嗪基團，合成了蘆薈大黃素衍生物AE-YJ。在炎癥反應中，iNOS和COX-2大量表達并催化產生大量的NO和PGE2。過量的NO又會誘發炎性疾病的發生發展[18]。結果顯示AE-YJ可以有效抑制LPS誘導RAW264.7細胞和小鼠腹膜原發性巨噬細胞釋放NO。驚喜的是，相較于AE，AE-YJ顯示出更為強烈的抑制NO釋放的活性。由于化合物直接清除NO也可以造成細胞培養上清中NO含量減少，為檢查AE-YJ是否對NO自由基有影響，采用了SNP釋放NO的無細胞體系，實驗也證明了AE-YJ無直接清除NO的作用(Fig 3)。此外，炎性介質(例如PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β)在炎癥疾病的發展中也起著關鍵作用。實驗數據顯示AE-YJ可明顯降低LPS刺激RAW264.7細胞中PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β(Fig 4)的產生，AE-YJ顯示出比AE更好的抗炎活性，AE-YJ更明顯的抑制炎性細胞因子釋放。這些結果表明，AE-YJ具有抗炎活性，這可能是通過抑制炎性介質的產生而發揮作用。iNOS和COX-2[18]的蛋白表達直接影響NO和PGE2的量。研究結果顯示AE-YJ明顯抑制iNOS和COX-2的表達(Fig 6)。

Akt是葡萄糖代謝和細胞生長中重要的調節分子，調控細胞周期和細胞增殖。炎癥中，Akt的異常表達會促進IκBα的降解，介導NF-κB途徑的活化。本研究表明，LPS刺激30 min后，Akt的磷酸化增加，IκBα的降解以及IκBα和p65的磷酸化也明顯增加，提示NF-κB的激活明顯增加。AE-YJ處理可以有效抑制Akt的磷酸化，明顯阻礙IκBα的降解，并明顯增加IκBα的表達(Fig 7,8)，免疫熒光和蛋白質印跡分析顯示p65易位入核減少(Fig 7)進而降低炎性相關蛋白基因的表達。因此，AE-YJ的抗炎機理可能與PI3K-Akt和NF-κB途徑有關。AE-YJ通過下調PI3K-Akt/NF-κB途徑來抑制炎癥介質和促炎細胞因子的表達。除NF-κB外，許多證據表明MAPK途徑在炎癥反應中也起重要作用。MAPK途徑調節細胞的生長周期，調控炎性細胞因子的產生。MAPK途徑在NF-κB通路的活化中起著重要作用。研究顯示AE-YJ明顯降低LPS誘導的p38、ERK和JNK的磷酸化和炎癥因子的表達。這可能是AE-YJ通過抑制MAPK信號通路的激活，直接降低炎性細胞因子的釋放。也有可能是AE-YJ通過抑制MAPK信號通路的激活，從而影響NF-κB途徑的活化。即AE-YJ通過MAPK/NF-κB途徑降低炎癥因子和炎癥相關蛋白基因的產生。因此，AE-YJ可能通過抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中的PI3K-Akt/NF-κB 和MAPK/NF-κB途徑降低炎性細胞因子PGE2、TNF-α、IL-6以及IL-1β的表達，進而發揮抗炎作用。

Fig 7 Effects of AE-YJ on NF-κB pathway in LPS-stimulated RAW264.7 cells ##P<0.01 vs control group;*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

Fig 8 Effects of AE-YJ on PI3K/Akt signaling in LPS-induced RAW264.7 ##P<0.01 vs control group;*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

Fig 9 Effects of AE-YJ on MAPK signaling pathway in LPS-induced RAW264.7 ##P<0.01 vs control group;*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

綜上所述，AE-YJ抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β的產生，同等劑量下，AE-YJ顯示出比AE更強的抗炎活性。AE-YJ的抗炎作用機制可能是通過PI3K-Akt/NF-κB和MAPK/NF-κB途徑下調iNOS、COX-2以及IL-6、IL-1β和TNF-α的表達。