白藜蘆醇苷通過MAPK和Nrf2/HO-1通路減輕LPS引起的炎癥反應

楊 君，沙前坤，李玉先，陳 瑾，龍 馨，顏 麗，張 華

(1.重慶市婦幼保健院宮頸疾病診治中心,重慶 400021;2.重慶央都生物研究院藥學部,重慶 408000;3.重慶醫(yī)科大學北碚附屬醫(yī)院,重慶 400700;4.重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400011；5.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科,重慶 400016)

炎癥是天然免疫反應的關鍵因素，可以減輕組織損傷。但是炎癥持續(xù)時間過長，組織損傷程度會加重[1-2]。研究表明LPS是革蘭氏陰性菌外膜內毒素的致病成分，能夠激活多種信號通路，如免疫和炎癥反應的紊亂等[3]。白藜蘆醇苷(piceid，PD)是從傳統(tǒng)中藥虎杖中提取的單體化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，PD具有多種重要的生物學功能，如抗氧化、抗血栓形成等。以PD作為主要活性成分的虎黃燒傷搽劑(生產廠家：重慶喜旋生物科技有限公司，規(guī)格：50 mL/瓶，批準文號：國藥準字Z20010151)能夠促進創(chuàng)面愈合，調控機體免疫能力。然而其在抗炎作用中的研究機制尚未闡明。本研究旨在探究PD在LPS引起的炎癥反應中的影響及分子機制，為揭示PD的治療機制以及其在臨床用藥中的運用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料PD(批號:09042022)購自美國LKT實驗室，用二甲基亞砜(DMSO)(購自國藥集團化學試劑有限公司)溶解配制成10 mmol·L-1的貯存液儲藏于-20 ℃冰箱。抗體Anti-JNK1/2兔抗人單克隆抗體、Anti-ERK1/2鼠抗人單克隆抗體購自Abcam公司，Anti-p38MAPK、Anti-p-JNK1/2、Anti-p-ERK1/2和Anti-p-p38MAPK兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司。ELISA試劑盒購自Abcam公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自Bio-Rad公司，細胞裂解液RIPA購自碧云天生物技術有限公司。羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均購自美國Santa Cruz公司，引物序列由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) RAW264.7(小鼠巨噬細胞)細胞系來自中國科學院細胞庫。細胞系在DMEM高糖正常培養(yǎng)基(包括10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素)在加濕5% CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT 采用MTT法測定細胞活力。將1×105RAW264.7細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，然后用PD(0、1.0、3.0、5.0 μmol·L-1)處理48 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)，培養(yǎng)3 h。然后去除培養(yǎng)基，用DMSO(100 μL/孔)溶解結晶紫，最后用酶標儀在570 nm處測定。

1.2.3Western blot 將RAW264.7細胞接種，過夜培養(yǎng)。LPS(1 mg·L-1)誘導2 h，在指示時間點PD(20、40、80 μmol·L-1)進行預處理。用RIPA (1% PMSF和1% DTT)提取總細胞蛋白，提取細胞質和核蛋白。采用BCA蛋白試劑盒測定蛋白質濃度，變性蛋白用SDS-PAGE凝膠分離并轉移到PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，PVDF膜與一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜孵育。之后用TBST洗滌，并與二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育2 h。利用Bio-Rad發(fā)光試劑盒與Chemi DocTMMP成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4 流式細胞儀檢測密度為1.5×105RAW264.7細胞接種于24孔板過夜。用PD預處理細胞1 h，然后用LPS(1 mg·L-1)處理2 h。用不同的探針檢測相應的指標，包括NO檢測器DAF-FM (5 μmol·L-1，1 h)，ROS檢測器DCFH2-DA(10 μmol·L-1，30 min)，Ca2+檢測器Fluo-3/AM(1 μmol·L-1，1 h)或MMP 檢測器JC-1(10 mg·g-1，30 min)。探針孵育后，用流式細胞儀(BD，美國)采集細胞并進行檢測。

1.2.5免疫熒光染色 RAW264.7細胞以1.5×108個·L-1的密度接種到共聚焦培養(yǎng)皿中過夜，用PD預處理4 h，并用LPS刺激(1 mg·L-1)預處理2 h。固定、打孔、封閉后，將培養(yǎng)皿中的細胞與抗體在4 ℃下孵育過夜。最后將細胞與Alexa Fluor 594二抗孵育1 h。Hoechst 33342染色顯示細胞核。在共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(Leica，Wetzlar，德國)下收集熒光圖像。

1.2.6ELISA 按照說明書準備所有試劑，工作標準液和樣品。將50 μL所有樣品或標準液加到適當?shù)目字小Ｔ诿總€孔中加入50 μL抗體混合物。密封板并在設置為400 r·min-1的振蕩器上于室溫孵育1 h。用350 μL 1×Wash buffer PT清洗3次。晾干以除去多余的液體。每孔中加入100 μL TMB顯影液，并在避光中在設置為400 r·min-1的平板振蕩器上孵育10 min。每孔中加入100 μL終止溶液。在平板振蕩器上將平板搖晃1 min以進行混合記錄450 nm處的OD。

1.2.7熒光測定 RAW264.7細胞以4×108個·L-1的密度過夜接種于96孔板中。用PD預處理細胞1次，然后在有或沒有LPS的情況下再孵育2 h。用JC-1(10 mg·L-1)和DCFH2-DA(100 μmol·L-1)染色30 min。最后通過熒光顯微鏡捕獲熒光圖像。

2 結果

2.1 PD減少LPS引起的炎癥反應利用MTT試驗,計算不同濃度的PD(1.0、3.0、5.0 和7.0 μmol·L-1)處理后的細胞生存率，結果提示不同濃度的PD處理細胞48 h后，細胞的存活率分別為(98.56%、96.51%、96.56%、87.24%)。因此，在后續(xù)實驗中將選用濃度1.0-5.0 μmol·L-1。

利用流式細胞術檢測PD對于上述指標的影響，發(fā)現(xiàn)PD預處理呈劑量依賴性的方式抑制LPS刺激的亞硝酸鹽水平和iNOS蛋白的表達。如Fig 1所示，LPS處理的細胞亞硝酸鹽水平急劇升高。流式細胞術檢測表明，PD可以減少細胞NO生成。COX-2蛋白的表達無影響。

Fig 1 PD reduced LPS-induced inflammatory A:PD cytotoxicity in RAW264.7 cells;B:PD reduced the inflammatory response;C:Effect of PD on the expression of COX-2 and iNOS;D:Flow cytometry detection and analysis.*P<0.05 vs LPS group

2.2 PD減少LPS誘導的促炎細胞因子的表達利用ELISA檢測PD處理后相關因子的水平，結果顯示，LPS誘導促炎細胞因子TNF-α和IL-6的產生(Fig 2)。同時，用PD預處理可明顯抑制LPS處理后TNF-α和IL-6的產生。

Fig 2 PD reduced expression of LPS-induced pro-inflammatory A、B：ELISA of TNF-α and IL-6 levels;C：Flow cytometry analysis of Fluo-3/AM labeled cells.*P<0.05 vs LPS group

2.3 PD對于MAPK和Nrf2/HO-1通路的影響利用蛋白印記方法檢測MAPK和Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達，如Fig 3所示，PD明顯抑制 p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-p38MAPK的蛋白水平，但對JNK1/2、ERK1/2和p38MAPK總量的表達無影響。

Fig 3 Effect of PD on MAPK and Nrf2/HO-1 *P<0.05 vs LPS group

2.4 PD抑制活性氧的生產和降低線粒體膜電位利用DCFH2-DA檢測ROS的產生，結果表明，PD明顯抑制LPS誘導的RAW264.7細胞ROS生成(Fig 4A)。

Fig 4 PD inhibited production of reactive oxygen species and reduced mitochondrial membrane A、B、C：Immunofluorescence and intracellular ROS kit to detect intracellular ROS production;D：JC-1 probe to detect cell mitochondrial membrane potential (MMP).*P<0.05 vs LPS group.

另外還采用免疫熒光法和細胞內ROS試劑盒檢測細胞內ROS的產生。結果表明，PD降低了細胞內ROS水平(Fig 4B、C)。LPS破壞線粒體膜電位(MMP)的穩(wěn)定性，不利于維持細胞正常的生理功能。本研究利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)通過LPS刺激(綠色染色)增加JC-1單體，但PD的預處理降低了JC-1單體，使其恢復為聚集體(紅色熒光)(Fig 4D)。

2.5 PD對Keap1-Nrf2信號通路的影響研究表明，LPS可激活巨噬細胞中的Nrf2信號通路。在本研究檢測PD對Keap1-Nrf2信號通路的影響。如Fig 5所示，LPS刺激可誘導Keap1表達上調，而PD預處理則Keap1蛋白表達略有下調。用PD預處理可增加RWA264.7細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達。與NC和LPS刺激組相比，PD的預處理提高了細胞核中Nrf2蛋白水平，但降低了細胞質中的蛋白水平。

Fig 5 Effect of PD on Keap1-Nrf2 signaling A:Keap1,Nrf2y and HO-1 level detection;B:Nuclear and cytoplasmic Nrf2 level detection;C:Quantitative analysis of differences in Keap1,Nrf2y and HO-1 level of each group).*P<0.05 vs LPS group

2.6 Toll樣受體參與PD的抗炎過程在多個細胞上特異性發(fā)現(xiàn)的TLR4在炎癥過程中起著重要的作用。在LPS和MD2存在下，TLR4二聚，調節(jié)NF-κB、MAPK和其他信號級聯(lián)，通過促炎細胞因子釋放誘導病原體特異性天然免疫反應。為了評價TLR4是否參與PD的抗炎過程，采用蛋白印跡檢測不同濃度PD處理后TLR4的表達情況。我們的結果表明，PD減弱了LPS誘導的TLR4的表達(Fig 6)。

Fig 6 Toll-like receptors involved in anti-inflammatory *P<0.05 vs LPS group

3 討論

炎癥反應是生命中常見的病理反應，存在于各種組織和器官中[1]。炎癥與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程有關，包括中風、關節(jié)炎、神經退行性疾病和心血管疾病等[2]。因此，抑制炎癥在炎癥相關疾病治療中起關鍵作用。PD具有多種重要的生物學功能，如抗氧化、抗血栓形成等，然而其抗炎作用的研究還相對較少。基于傳統(tǒng)中藥研究的經驗，PD的藥用價值使其被添加到越來越多的成藥中。具有代表性的成藥虎黃燒傷搽劑，以PD為主要活性成分，其治療燒傷效果顯著，主要的適應癥為嚴重燒傷引起的休克和細菌感染等。本文旨在進一步探索PD抗炎作用的分子機制，為拓展其臨床應用打下理論基礎。

本研究采用LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)PD減少LPS引起的炎癥反應，并減少LPS誘導的促炎細胞因子的表達。而且大量證據(jù)表明與TLR4結合的LPS可以激活許多炎癥途徑，如MAPKs途徑[2-6]。據(jù)報道TLR4和MAPKs信號通路參與炎癥反應[6]。在LPS誘導的RAW264.7細胞中增強JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化[7]。本研究顯示PD明顯抑制了JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化，而沒有改變總JNK1/2、p38、ERK1/2蛋白質水平的激活。此外，我們的結果表明TLR4參與PD的抗炎過程。綜上所述，PD通過介導NF-κB和MAPKs途徑表現(xiàn)出抗炎作用。

文獻報道ROS的產生介導了各種炎癥信號通路，從而促進了炎癥反應[8]。MMP以及ROS45也是重要的炎癥反應信號。因此抑制ROS或促進MMP可能也是炎性疾病最重要的治療靶點[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD明顯降低了ROS的產生并恢復了線粒體膜電位，從而減輕了炎癥反應。

越來越多的證據(jù)表明，HO-1是一種抗氧化酶，在血紅素降解中起著至關重要的作用，是氧化應激和炎癥細胞病理生理條件的重要機制[8]。本研究結果表明，用PD預處理可降低Keap1表達，促進Nrf2核易位并在體外誘導HO-1。更有文獻報道Nrf2作為調節(jié)HO-1表達的主要蛋白，通常與Keap1一起分布在細胞質中。但是，當Keap1在氧化應激下降解時，Nrf2釋放并遷移到細胞核，然后誘導HO-1表達[9-11]。

LPS誘導其下游通路的活化可導致細胞分泌大量的炎癥因子，同時使iNOS和NO表達增加。然而MAPKs在LPS誘導的細胞反應中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導激活MAPK通路。此外HO-1對于降低促炎COX-2和iNOS水平至關重要，這有助于減少COX-2衍生的PGE2和iNOS衍生的NO的產生[12]。HO-1是由Nrf2介導的，通過調節(jié)抗氧化反應，Nrf2在改善細胞氧化應激和炎癥損傷方面起著至關重要的作用。在正常情況下，Nrf2位于細胞質中，其抑制蛋白是Keap1[13-14]。在應激條件下，Nrf2與Keap1解離，轉運到細胞核中，與抗氧化反應元件結合，從而誘導Ⅱ期解毒酶和細胞保護基因，如HO-1[11,15-17]。綜上，PD可能通過MAPK和Nrf2/HO-1通路對RAW264.7細胞表現(xiàn)出抗炎和抗氧化作用。因此，PD可以作為研究和開發(fā)炎性疾病的潛在藥物。