羥基紅花黃色素A通過激活自噬抑制ANG Ⅱ誘導的VAFs遷移

崔清卓，劉博宇，李穎云，鄭玉光 ，安勝軍，劉 玉，李愛英，趙京山,

(1.河北中醫學院藥學院，河北省中藥炮制技術創新中心,2.河北中醫學院科技處，3.河北省心腦血管病重點實驗室，石家莊 050200)

動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、PTCA術后血管再狹窄等心血管疾病是威脅人類健康的頭號殺手，致死率高，現已呈年輕化趨勢[1]，發病機制有待進一步研究。心血管疾病有相似的病理基礎—血管重構，又稱為血管重構性疾病，常表現為血管壁細胞異常活化、增殖及遷移。通常動脈粥樣斑塊出現在血管內膜，造成血管內膜狹窄，引發一系列病變，故一般認為血管病變“從內膜開始”，隨著研究的深入，發現血管外膜也在血管病變中發揮著重要作用，有觀點認為血管病變“由外而內”發生[2]。血管外膜成分復雜，包括成纖維細胞、間充質干細胞、祖細胞、巨噬細胞等，血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)是血管外膜中最主要的細胞成分，對血管損傷最早做出反應，表現為異?；罨?，通過分泌多種細胞因子，如成纖維特異性因子1、血管緊張素轉換酶1等參與血管重構，促進內膜增生，甚至遷移至血管內膜，直接參與血管重構[3-4]。抑制VAFs遷移有望成為治療血管重構性疾病的新靶點。近年研究發現自噬與心血管疾病密切相關，研究顯示自噬激活抑制內皮細胞或平滑肌細胞增殖、遷移進而改善動脈粥樣硬化[5]，然而自噬激活對血管外膜成纖維細胞遷移的作用未見報道。

心血管疾病如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，在中醫中屬于胸痹的范疇，是心脈痹阻所致，臨床常用活血化瘀藥治療。而紅花是常用的活血化瘀藥之一。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是藥典規定鑒定紅花的標志物，是其活血化瘀的主要有效成分，在臨床治療心血管疾病中發揮著重要作用[6-7]，研究顯示HSYA對Ang Ⅱ誘導的大鼠VAFs增殖和膠原合成有抑制作用[8]。本實驗主要探討HSYA是否通過調控自噬抑制Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移作用，為臨床新藥研發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 6周齡雄性SD大鼠，清潔級，體質量160 g左右，購買于河北省實驗動物中心，動物生產編號：IP07187。

1.1.2藥品與試劑 羥基紅花黃色素A(S26799，上海源葉生物科技有限公司)；angiotensin Ⅱ(A9290-10，北京索萊寶公司)；DMEM/F12培養基(01447，美國Gibco公司)；胎牛血清(20050405，杭州四季青生物科技有限公司)；CCK-8溶液(SB-CCK8S，上海圣爾生物有限公司)；MDC染色試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；GAPDH兔抗大鼠抗體(ab8245，英國Abcam公司)；α-SMA兔抗大鼠抗體(CY5295，Abway抗體公司)；Vimentin兔抗大鼠抗體(CY5134，Abways抗體公司)；LC3(00084321，武漢三鷹生物技術有限公司)；Beclin1兔抗大鼠抗體(00073614，武漢三鷹生物技術有限公司)；p62兔抗大鼠抗體(00069958，武漢三鷹生物技術有限公司)；IgG(H+L)HRP羊抗兔抗體(ab0101,Abway抗體公司)。

1.1.3實驗儀器 超凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司)；細胞培養箱(311，賽默飛世爾科技有限公司)、酶標儀(VICTOR Nivo，德國Perkln Elmer公司)；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(ECLIPSE Ts2，日本Nikon公司)；高速離心機購于Eppendorf(Germany)公司；電泳、電轉膜儀(1645050，美國Bio-Lad公司)；多功能成像系統(Fusion FX5 Spectra，法國Vilber公司)；

1.2 實驗方法

1.2.1貼塊法培養 VAFs 25%烏拉坦麻醉SD大鼠(腹腔注射給藥：10 μL·g-1)，使用高壓滅菌的手術器械在無菌條件下剪去皮毛，逐層開腹，剪取胸主動脈，PBS清洗干凈后，浸泡于培養基中，顯微器械剪去周圍脂肪組織及結締組織剝凈血管，縱向剖開，洗去血管內殘留血跡，彎鑷輕輕刮去內膜及中膜，將血管外膜剪成約1 mm2的小塊貼于無菌培養皿中，待組織塊貼牢且不能干透時，加入15%胎牛血清培養基(85% DMEM/F12培養基+15%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素混合物)，置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養，2-3 d即可爬出細胞，待細胞融合度達90%以上，去除組織塊，采用胰酶消化法進行傳代，選用第3代第6代細胞用于實驗。

1.2.2免疫熒光鑒定VAFs 將細胞以5×104個/孔鋪于提前放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，棄去上清，用PBS清洗兩遍；加入0.25%Triton X 100，孵育5 min進行細胞打孔；PBS搖洗3遍，每次5 min；山羊血清封閉液37 ℃孵育30 min；兔抗鼠Vimentin、α-SMA抗體(1 ∶200)分別37 ℃孵育1 h；PBS搖洗3遍，每次5 min；驢抗兔CY3熒光抗體37 ℃避光孵育30 min；PBS搖洗3遍，每次5 min；用含DAPI的抗淬滅封片劑封片；于倒置熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.2.3CCK-8法建立Ang Ⅱ 量效和時效曲線 將細胞以3 000個/孔鋪于96孔板，待細胞貼壁，長勢穩定后，饑餓培養12 h，設置不同濃度梯度的Ang Ⅱ(0、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)，每個濃度設置6個復孔，另外設置空白對照組(即不加細胞的溶劑對照組)，各組加入100 μL含對應濃度Ang Ⅱ的培養基，細胞培養箱中孵育24 h，依據CCK-8試劑盒說明書，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h后，酶標儀中測490 nm處吸光度值，并計算細胞活力(cell viability)。

細胞活力=(A給藥組-A空白組)/(A正常組-A空白組)

將細胞以3 000個/孔鋪于96孔板，待細胞貼壁，長勢穩定后，饑餓培養12 h，采用含有量效曲線所確定最佳Ang Ⅱ濃度的培養基培養細胞，設置不同時間梯度，每個時間點設置6個復孔，另外設置空白對照組，分別于0、12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續培養1 h后，于490 nm處檢測吸光度值，計算細胞活力。

1.2.4CCK-8法建立HSYA量效和時效曲線 將細胞以3 000個/孔鋪于96孔板，待細胞貼壁，長勢穩定后，饑餓培養12 h，設置不同濃度梯度的HSYA(0、5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)，每個濃度設置6個復孔，另外設置空白對照組(即不加細胞的溶劑對照組)，各組加入100 μL含不同濃度HSYA的含藥培養基，于細胞培養箱中孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h后，酶標儀中測490 nm處吸光度值，計算細胞活力。

將細胞以3 000個/孔鋪于96孔板，待細胞貼壁后，饑餓培養12 h，設置不同時間梯度(0、12、24、48 h)，每個梯度設置6個復孔，另外設置空白對照組，各組加入含有量效曲線所確定最佳HSYA濃度的培養基培養細胞，分別于0、12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續培養1 h后，于490 nm處測吸光度值，計算細胞活力。

1.2.5細胞分組 細胞分為NC組，Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ+HSYA組，Ang Ⅱ+ HSYA+Baf組，Ang Ⅱ+Baf組。各組細胞處理如下：除NC組給予正常培養基，余組均以含Ang Ⅱ 10-7mol·L-1培養基培養24 h，各給藥組建立Ang Ⅱ誘導模型后，Ang Ⅱ組恢復正常培養基，3個藥物治療組分別給予含40 μmol·L-1HSYA，40 μmol·L-1HSYA+100 nmol·L-1Baf，100 nmol·L-1Baf的培養基，繼續干預24 h。

1.2.6細胞劃痕實驗檢測HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移的作用 將細胞以2×105個/孔鋪于6孔板中，待細胞融合度達100%，饑餓培養12 h后，用黃槍槍頭在6孔板中劃痕，并拍照記錄，記0 h，細胞處理如“1.2.5”，處理結束后，拍照記錄，記24 h，隨機取3個劃痕視野計數單位面積內遷移的細胞個數，拍照后收集各組細胞提蛋白用作Western blot實驗。

1.2.7MDC法檢測自噬小體 將細胞以5×104個/孔鋪于提前放置有蓋玻片的24孔板，細胞處理如“1.2.5”，參照MDC試劑盒說明書進行，4%多聚甲醛室溫固定25 min；1×Washing buffer清洗3遍；MDC染色工作液室溫染色45 min；1×Washing buffer 清洗3遍；將Collection buffer滴于蓋玻片上，于熒光顯微鏡下觀察，并計數單位面積自噬斑點數量。

1.2.8Western blot實驗 收集各組細胞，加入一定量蛋白裂解液(蛋白裂解液為RAPI ∶蛋白酶抑制劑=100 ∶1)，冰上裂解30 min；離心：4 ℃，12 000 r·min-1，15 min；取上清，利用Lowrry法測定蛋白含量；按比例加入一定量4× Loading buffer，98 ℃，煮沸5 min；配制12% SDS-Page膠，每組蛋白上樣約20 μg進行電泳，電泳條件設置為80 V，35 min，120 V，50 min；濕轉法將蛋白電轉至PVDF膜上，設置為300 mA，1 h 10 min；5%脫脂奶粉，常溫孵育2 h；兔抗鼠一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，10 min/次，洗3次；山羊抗兔二抗常溫孵育50 min；TBST洗膜，10 min/次，洗3次；條帶浸泡于ECL發光液(A液 ∶B液=1 ∶1)，進行化學發光，用Vision Capt進行數據分析。

2 結果

2.1 細胞培養與鑒定本實驗成功從大鼠胸主動脈血管外膜中培養出VAFs，VAFs成梭形(Fig 1)，并通過免疫細胞熒光實驗檢測VAFs的標志蛋白Vimentin表達陽性，平滑肌細胞標志蛋白α-SMA表達陰性(Fig 2)。

Fig 1 Pictures of cell cultures (×40)A:P0 generation;B:P1 generation;C:P2 generation;D:P3 generation

Fig 2 Expression of vimentin and α-SMA proteins in VAFs (×100)(n=3)Vimentin or α-SMA：Red；The nucleus：Blue

2.2 Ang Ⅱ的時效量效曲線采用CCK-8法檢測不同濃度、不同時間Ang Ⅱ對VAFs增殖活力的影響，Fig 3A結果顯示，隨著劑量的增加，Ang Ⅱ對VAFs的增殖活力，先呈劑量依賴性增大，后呈劑量依賴性減小，在10-7mol·L-1濃度時，Ang Ⅱ對VAFs的增殖作用最明顯(P<0.01)，后續實驗Ang Ⅱ 的濃度采用10-7mol·L-1。10-7mol·L-1的Ang Ⅱ對不同時間的VAFs增殖作用的結果顯示(Fig 3B)，隨著時間的延長，Ang Ⅱ對VAFs的增殖活力呈現先升高后降低的趨勢，其中12 h、24 h對VAFs細胞活力增強最明顯(P<0.01)。

Fig 3 Effect of Ang Ⅱ on VAFs cell n=6)A：Effects of different concentrations of Ang Ⅱ on VAFs cell viability；B：Effects of different time of Ang Ⅱ on VAFs cell viability.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 group.

2.3 HSYA的時效量效曲線采用CCK-8法檢測不同濃度HSYA對VAFs增殖活力的作用，結果顯示(Fig 4A)，隨著劑量的增加，VAFs增殖活力呈劑量依賴性降低，且濃度>20 μmol·L-1時，HSYA對VAFs增殖抑制，差異具有顯著性(P<0.05)，當濃度大于80 μmol·L-1時，HSYA對細胞產生毒副作用(Fig 4C)，本實驗采用對VAFs增殖活力抑制最明顯，且對細胞無細胞毒性的濃度，即40μmol·L-1進行后續實驗。采用CCK-8法檢測不同時間HSYA(40 μmol·L-1)對VAFs增殖活力的影響，Fig 4B結果顯示，隨著時間的延長，40 μmol·L-1的HSYA對VAFs的增殖活力呈時間依賴性降低，在作用48 h時出現細胞毒(Fig 4D)，選擇對細胞增殖活力抑制作用明顯(P<0.05)且沒有毒性作用的24 h進行后續實驗。

Fig 4 Effect of HSYA on VAFs cell n=6)A：Effects of different concentrations of HSYA on VAFs cell viability；B：Effects of different time of HSYA on VAFs cell viability；C and D.Images of different concentrations and time of HSYA on VAFs (×40)；*P<0.05，**P<0.01 vs 0 group.

2.4 HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移的作用為初步探究HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移的作用，細胞分為3組：NC組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+HSYA組。采用細胞劃痕實驗檢測HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移的作用，Fig 5結果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ明顯促進VAFs的遷移(P<0.01)，HSYA干預24 h后，能有效抑制VAFs的遷移(P<0.01)。

Fig 5 Effect of HSYA on migration of A：HSYA inhibited Ang Ⅱ-induced VAFs migration(×40)；B：**P<0.01 vs NC group,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group.

2.5 HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs的自噬小體形成的影響采用MDC法檢測HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs自噬小體形成的作用，Fig 6結果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ 刺激24 h后，VAFs中自噬小體增加(P>0.05)；與Ang Ⅱ組相比，HSYA刺激24 h后，明顯增加VAFs中自噬小體的數量(P<0.01)。

2.6 自噬抑制劑Baf對Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移的作用采用劃痕實驗檢測自噬抑制劑Baf對Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移，Fig 7結果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ 組細胞遷移數量明顯增加(P<0.01)，HSYA干預24 h后，VAFs細胞遷移數量明顯減少(P<0.01)。與HSYA組相比，Baf組VAFs遷移數量明顯增加(P<0.05)，與Baf組相比，Baf與HSYA共處理組VAFs細胞遷移數量明顯減少(P<0.05)。

2.7 自噬抑制劑Baf對Ang Ⅱ誘導VAFs自噬小體形成的影響采用MDC實驗檢測自噬抑制劑Baf對Ang Ⅱ誘導的VAFs自噬小體數量的影響，Fig 8結果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ組自噬斑點數量明顯增加(P<0.05)；與Ang Ⅱ相比，HSYA明顯增加了自噬熒光斑點的數量(P<0.05)，HSYA與Baf共處理組呈相同趨勢，與HSYA和Baf共處理組相比，Baf處理自噬小體數量明顯降低(P<0.05)。

2.8 HSYA對Ang Ⅱ誘導的VAFs中自噬相關蛋白表達的作用采用Western blot實驗檢測自噬相關蛋白表達，Fig 9結果顯示，與正常組相比，Ang Ⅱ處理組自噬相關蛋白表達無明顯影響；與Ang Ⅱ組相比，HSYA處理明顯增加自噬相關蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ的表達，降低p62蛋白表達(P<0.05)；與HSYA處理組相比，HSYA和Baf共處理后自噬相關蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ表達明顯升高(P<0.05)；與HSYA和Baf共處理組相比，Baf單獨處理組自噬相關蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ 表達明顯降低(P<0.05)，p62蛋白表達升高(P>0.05)。

Fig 7 Effect of HSYA and autophagy inhibitor on migration of Ang Ⅱ-induced n=3)A：Wound healing assay(×40);B：The number of migrated cells.1:NC;2:AngⅡ;3:AngⅡ+HSYA;4:AngⅡ+HSYA+Baf;5:AngⅡ+Baf;**P<0.01 vs NC group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;△P<0.05 vs Ang Ⅱ+HSYA group.

Fig 8 Effect of HSYA and autophagy inhibitor on number of autophagosomes in Ang Ⅱ-induced n=3)A：The autophagosomes are shown in blue(×100)；B：The number of autophagosome;1:NC;2:AngⅡ;3:AngⅡ+HSYA;4:AngⅡ+HSYA+Baf;5:AngⅡ+Baf;*P<0.05 vs NC group;#P<0.05 vs Ang Ⅱ group;△P<0.05 vs Baf group.

Fig 9 Effect of HSYA on protein expression of LC3,Beclin1 and p62 in Ang Ⅱ-induced n=3)1:NC;2:AngⅡ;3:AngⅡ+HSYA;4:AngⅡ+HSYA+Baf;5:AngⅡ+Baf;**P<0.01 vs Ang Ⅱ group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ+HSYA group;△P<0.05,△△P<0.01 vs Ang Ⅱ+HSYA+Baf group.

3 討論

21世紀初，Li等[9]利用LacZ標記追蹤發現了大鼠頸動脈球囊損傷模型中外膜成纖維細胞遷移至血管內膜的直接證據，研究表明在內膜出現增生之前，LacZ標記的成纖維細胞已經遷移至內膜；血管外膜成分復雜，與內膜的距離較遠，然而越來越多的研究顯示血管外膜是血管損傷的最早啟動者，甚至是主導者[10]。Kadota等[11]研究發現，在肺纖維化中，成纖維細胞的外囊泡促進上皮細胞衰老，推動疾病進程；Tong等[3]研究顯示，來自原代培養自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)血管外膜成纖維細胞的外泌體，促進WKY大鼠血管平滑肌細胞遷移，其機制可能是SHR大鼠VAFs通過分泌血管緊張素轉換酶促進中膜平滑肌細胞遷移，加劇血管重構。越來越多的證據顯示，常被忽略的VAFs在疾病發生發展過程中發揮重要作用。

細胞自噬是目前的研究熱點，自噬通過降解受損細胞器或細胞質蛋白等維持細胞穩態，多種疾病均與自噬相關[12]，心血管疾病也與自噬有著密切關系[13]，研究表明，激活自噬可減輕動脈粥樣硬化，抑制內皮細胞增殖、遷移，機制可能是通過調控自噬抑制NLRP3炎性小體[14]，提示自噬對細胞穩態的調控至關重要。自噬是把雙刃劍，另有研究表明，抑制自噬可抑制血管平滑肌細胞增殖，進而改善血管重構[15]，延緩動脈粥樣硬化的進程。自噬與心血管疾病密切相關，有望成為改善或治療疾病的新靶點。

紅花活血化瘀，臨床常用于治療心血管疾病[16]，HSYA是活血化瘀中藥紅花中的主要有效成分，具有多種藥理活性，Zhang等[17]研究發現HSYA通過抑制缺氧/復氧心肌細胞氧化應激反應，減少心肌細胞損傷；另有研究顯示HSYA通過激活自噬抑制炎癥反應緩解大鼠心臟缺血/再灌注損傷[18]。HSYA是否通過調控自噬抑制VAFs異常遷移，從而改善血管重構尚未見報道。

本實驗以原代培養的胸主動脈外膜成纖維細胞為研究對象，通過Ang Ⅱ誘導建立VAFs活化模型，探究HSYA對VAFs遷移的影響。Vimentin和α-SMA分別是VAFs和血管平滑肌細胞(VSMCs)的標志蛋白，免疫熒光實驗結果顯示(Fig 2)，所培養細胞Vimentin蛋白表達陽性，說明貼塊法培養得到的細胞是VAFs；α-SMA蛋白表達陰性，說明培養得到的細胞中不含有VSMCs，該結果表明原代培養的VAFs獲得成功。采用CCK-8法檢測不同濃度、不同時間Ang Ⅱ對VAFs細胞活力的影響，建立Ang Ⅱ對VAFs細胞活力影響的量效時效曲線(Fig 3)，確定Ang Ⅱ對VAFs細胞活力影響的最佳濃度和時間分別為10-7mol·L-1和24 h，因此，后續實驗選用10-7mol·L-1Ang Ⅱ刺激24 h進行試驗；同樣方法建立HSYA和VAFs細胞活力影響的量效時效曲線(Fig 4A)，確定HSYA最佳濃度和時間分別為40 μmol·L-1和24 h，后續實驗選用40 μmol·L-1HSYA刺激24 h進行試驗。

劃痕實驗結果顯示(Fig 5)，Ang Ⅱ誘導VAFs遷移活性增加，經HSYA處理后明顯抑制遷移；MDC實驗結果顯示(Fig 6)，HSYA處理后明顯增加自噬熒光斑點數量，以上兩個結果初步表明HSYA可能通過激活自噬抑制Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移。為了確證HSYA對VAFs自噬和遷移的作用，課題組在上述實驗的基礎上，加入自噬抑制劑Baf，Baf抑制自噬小體和溶酶體的結合，加入Baf后，自噬小體無法與溶酶體結合降解自噬小體，造成自噬小體堆積，進而抑制自噬的進程。加入Baf的劃痕實驗結果顯示(Fig 7)，Ang Ⅱ+HSYA+Baf組較Ang Ⅱ+HSYA組遷移細胞數增多，兩組結果差別明顯，說明抑制自噬后VAFs遷移增強，證明了HSYA通過激活自噬，抑制Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移，結果提示HSYA通過激活自噬抑制Ang Ⅱ誘導的遷移。為了進一步確認此結果，采用同樣的分組，用MDC法檢測自噬小體的數量，結果顯示(Fig 8)，與Ang Ⅱ組相比，HSYA處理后自噬小體明顯增加，HSYA和HSYA與Baf共處理均進一步增加了自噬小體數量，提示自噬小體堆積增加，驗證了HSYA對自噬起促進作用，進一步驗證了HSYA通過激活自噬抑制Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移。

自噬小體的形成是自噬發生的關鍵環節，自噬小體的形成分為三個階段：自噬小體成核、自噬小體延伸、自噬小體成熟，自噬小體在形成過程中將受損的細胞器或蛋白包裹進來，然后成熟的自噬小體與溶酶體結合，形成自噬溶酶體，利用溶酶體中的溶解酶將自噬小體裂解，清除受損的細胞器或蛋白，最終完成自噬整個過程。Beclin1與Vps34和Vps15復合物結合完成自噬小體的延伸，再經過兩個泛素化樣系統，分別為Atg5-Atg12系統和LC3系統，進一步形成成熟的自噬小體，LC3 Ⅰ轉化為LC3 Ⅱ是自噬小體成熟的標志。p62也是參與自噬小體形成的關鍵分子，通常與自噬活動呈負性相關。為了確證HSYA通過激活自噬抑制VAFs遷移的初步機制，采用Western blot實驗檢測自噬相關蛋白Beclin1、LC3及p62蛋白表達，結果顯示，HSYA處理后Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表達明顯升高，表明自噬活動增強。Baf抑制自噬是通過抑制自噬小體與溶酶體的結合實現的，HSYA與Baf共處理后Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表達和LC3Ⅰ/LC3Ⅱ轉化進一步升高，p62蛋白表達降低，提示自噬小體增多，自噬作用增強，進一步驗證了HSYA對自噬起促進作用，進而抑制Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移。

綜上所述，HSYA通過激活自噬，抑制Ang Ⅱ誘導的VAFs遷移，改善血管重構，有望成為治療心血管疾病的新靶點。后續試驗將進一步在細胞水平探究HSYA調控自噬的機制，在整體水平探究 HSYA改善血管重構的作用機制。