大車前苷對氧嗪酸鉀誘導小鼠急性高尿酸血癥模型的影響

楊海艷，曾慶雅，歐陽香，王 陸，郭敏俠，李娜芝，程虹毓，朱繼孝

(江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是尿酸生成增加或者排泄減少從而導致體內尿酸高于正常值的代謝性疾病[1]，是導致痛風的主要原因。誘發HUA的因素主要有兩個，(1)尿酸來源增加，這主要與黃嘌呤氧化酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶等物質有關；(2)尿酸排出減少，主要與腎臟組織的尿酸轉運體有關[2]。氧嗪酸鉀(postassium oxonate,OA)是一種典型的尿酸酶抑制劑，可通過抑制尿酸酶活性來阻斷尿酸降解，從而導致血尿酸水平升高[3]。現階段，治療HUA的藥物主要包括以下幾類，分別為黃嘌呤氧化酶抑制劑(別嘌呤醇、非布索坦等)、尿酸氧化酶類似物(拉布立酶等)、URAT1抑制劑(丙磺舒、苯溴馬隆等)，其中別嘌呤醇和非布索坦被認為是治療普通痛風患者的一線藥物[4]。雖療效較佳，但其易引起肝腎損害等毒副作用，不適合長期服用[5]，因此，尋找更為安全有效的抗HUA藥物已成為世界醫藥科技研究者關注的熱點之一。

大量文獻報道，大車前苷PMS(plantamajoside,PMS)具有很高的藥用價值及廣泛的藥理作用，如可通過抑制食管鱗狀細胞癌細胞中的NF-κB信號傳導而抑制LPS的上皮-間質轉化[6]，還可通過抑制肝星狀細胞的活化而在肝臟中發揮抗纖維化作用[7]，近期研究表明PMS還可通過調節凋亡相關基因的表達水平及PI3K/AKT信號通路的激活來誘導細胞凋亡[8]。課題組前期研究[9]表明藏藥短穗兔耳草提取物能降低高尿酸血癥小鼠尿酸水平，并對藏藥短穗兔耳草的化學成分進行了探索，短穗兔耳草經一系列萃取處理后，從中鑒定出PMS[10]，且分別對17個批次短穗兔耳草進行了含量測定，PMS含量最高可達1.29%，平均含量為0.75%，PMS是藏藥短穗兔耳草的主要有效成分之一，因此本實驗在此基礎上基于TLR/MyD88/NF-κB和NLRP3信號通路和腎臟尿酸轉運體的變化，檢測小鼠腎組織轉運體GLUT9、OAT1、URAT1水平以及肝臟“TLR/MyD88/NF-κB”信號通路中蛋白TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB和NOD樣信號通路中受體蛋白NLRP3及炎癥因子IL-1β的表達水平，以期獲得短穗兔耳草降尿酸可能的活性成分與作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性昆明種小鼠60只，體質量(18-22)g，合格證號：SCXK(贛)2018-0003，購自江西中醫藥大學實驗動物科技中心。自由進水進食，飼養室溫度為25 ℃左右，適應性喂養7 d后進行實驗，符合實驗動物倫理委員會標準。

1.2 藥物與試劑大車前苷(成都普瑞法科技開發有限公司，批號PRF20081722，98%)；Allopurinol(Sigma公司，批號081M1112V)；Allantoxanic Acid Potassium Salt(Sigma公司，批號ST-BD5759V)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團，批號F20101222)；尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶、黃嘌呤氧化酶檢測測試盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20200921、20200909、20200924、20201023)；小鼠IL-1β、TNF-α ELISA測試盒(欣博盛生物有限公司，批號如下：M2010001-001a、M2010003-102a)；MyD88、NF-κB、NLRP3、TLR2、IL-1β、TLR4、Anti-OAT1、Anti-GLUT9抗體(英國abcam公司，批號分別為ab2064、ab16502、ab214185、ab213676、ab9772、ab217274、ab135924、ab223470)；Anti-URAT1一抗(武漢proteintech公司，批號為14937-1-AP)；二抗(武漢proteintech公司，批號為SA00001-2)；GAPDH(武漢proteintech公司，批號10494-1-AP)。

1.4 動物分組、造模及給藥選取60只昆明種雄性小鼠，適應性飼養7 d后，隨機均分為6組：空白組：0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，模型組：450 mg·kg-1OA(混懸于0.5% CMC-Na)，陽性組：450 mg·kg-1OA+10 mg·kg-1別嘌呤醇(混懸于0.5% CMC-Na)，PMS低劑量組：450 mg·kg-1OA+15 mg·kg-1PMS，PMS中劑量組：450 mg·kg-1OA+30 mg·kg-1PMS、PMS高劑量組：450 mg·kg-1OA+60 mg·kg-1PMS(PMS溶于水，使用超純水配制)，給予普通飼料、純水，自由飲食。本實驗采用預防性給藥聯合造模后給藥方式，以上各組連續給藥7 d，每天1次，最后一次給藥之前0.5 h注射450 mg·kg-1OA至小鼠腹腔造成HUA模型，并禁食。造模1 h后，小鼠眼眶采血，于5 000 r·min-1離心10 min，取其上清液置于4 ℃冰箱待用，立即于冰臺上取出小鼠一側腎臟和肝臟，-80 ℃冰箱貯存待測，摘取小鼠另一側全腎組織，用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 指標檢測

1.5.1血清尿酸的測定 參照小鼠尿酸試劑盒使用說明，檢測各組小鼠血清中尿酸表達水平。

1.5.2血清尿素氮的測定 參照小鼠尿素氮試劑盒使用說明，檢測各組小鼠血清中尿素氮表達。

1.5.3血清腺苷脫氨酶活性的測定 根據小鼠腺苷脫氨酶試劑盒使用說明，檢測各組小鼠血清中腺苷脫氨酶活性。

1.5.4肝組織黃嘌呤氧化酶活性的測定 參照小鼠黃嘌呤氧化酶試劑盒操作說明，檢測各組小鼠肝組織中黃嘌呤氧化酶活性。

1.5.5ELISA法檢測血清中IL-1β、TNF-α的表達水平 參照小鼠IL-1β、TNF-α試劑盒使用說明，檢測各組小鼠血清中IL-1β 和TNF-α 水平。

1.5.6Western blot法檢測 采用Western blot法檢測小鼠腎組織GLUT9、URAT1、OAT1蛋白的表達與肝組織TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白的表達。

1.5.6.1 腎臟組織蛋白提取 提取小鼠腎臟皮質刷狀緣膜(BBMV)蛋白及腎臟皮層蛋白，于1.5 mL EP管中，加入2% SDS 裂解液1 mL，制成腎組織勻漿室溫放置20 min待裂解充分，室溫1 000×g離心15 min，得上清液，100 ℃變性15 min，測定所有樣本的蛋白濃度(BCA試劑盒)，計算濃度并稀釋一致后，制備樣品進行常規上樣電泳(電泳條件80 V、30 min，120 V、1 h)，電泳完后于有轉膜液的轉膜槽中轉膜(250 mA，90 min)，轉膜后將PVDF膜浸泡于5%的脫脂牛奶中室溫搖床封閉2 h，洗膜3次(使用1×TBST)，共30 min，浸沒于一抗中，于4 ℃冰箱搖床孵育過夜，一抗的稀釋比例如下(TLR2，1 ∶1 000；TLR4，1 ∶1 000；NLRP3，1 ∶1 000；NF-κB，1 ∶2 000；MyD88，1 ∶1 000；IL-1β，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶5 000)，所有抗體用3% BSA稀釋，d 2取出洗膜后于水平搖床上二抗(稀釋比1 ∶5 000)孵育1 h，洗膜，ECL顯色。

本研究以海南11家高星級酒店為研究對象，從酒店經營者的角度出發，探討社交媒體營銷對高星級酒店的影響。根據采訪數據顯示，酒店經營者普遍認為社交媒體的出現和發展是互聯網經濟發展的必然產物，將社交媒體納入到酒店營銷體系里能為酒店的經營帶來極大的好處。大多數受訪者認為社交媒體平臺在酒店和消費者之間創造了一種紐帶關系。而這種紐帶關系又為將來的購買關系打下了堅實的基礎。如果紐帶關系和購買關系能夠一直保持良性循環，那么酒店顧客將有可能成為“意見領袖”，自愿為酒店代言，幫助酒店銷售其產品。

1.5.6.2 肝臟組織蛋白提取 剪60 mg小鼠肝臟放置1.5 mL的EP管內，加1 mL 2%SDS裂解液，組織勻漿儀磨碎后室溫條件下靜置20 min充分裂解，然后于1 000×g離心15 min后取其上清液，后續操作同“1.5.6.1”，一抗的稀釋比例為(GLUT9，1 ∶1 000；URAT1，1 ∶1 000；OAT1，1 ∶500；GAPDH，1 ∶5 000)，二抗(稀釋比1 ∶5 000)。

1.5.7小鼠腎臟HE染色病理組織學檢測 把腎臟從4%多聚甲醛溶液中轉移出，切成小方塊，置于包埋盒內，使用流水沖洗2 h，用梯度乙醇進行脫水處理、石蠟浸蠟、包埋、切片、HE染色等步驟，于顯微鏡下觀察，采集圖像分析腎臟損傷情況。

2 結果

2.1 各組藥物對高尿酸血癥小鼠尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶水平的影響與正常組比較，模型組小鼠尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性組小鼠尿酸水平明顯降低(P<0.01)，PMS中、高劑量組小鼠尿酸水平明顯降低(P<0.05)，PMS低、中劑量組小鼠尿素氮水平明顯下調(P<0.01)，PMS高劑量組小鼠尿素氮水平明顯降低(P<0.05)，陽性組與PMS低劑量組小鼠腺苷脫氨酶水平明顯降低(P<0.01)，PMS中、高劑量組小鼠腺苷脫氨酶水平明顯降低(P<0.05)；與陽性組比較，PMS低、中、高劑量組小鼠尿酸水平明顯上升(P<0.01)，正常組小鼠尿素氮水平明顯降低(P<0.05)，PMS低、中劑量組小鼠尿素氮水平明顯降低(P<0.01)，PMS低、中、高劑量組小鼠腺苷脫氨酶水平明顯上升(P<0.01或P<0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of different groups of drugs on serum UA,BUN, and ADA levels in hyperuricemia

2.2 各組藥物對高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響與正常組比較，模型組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，PMS中劑量組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶水平明顯降低(P<0.05)，陽性組、PMS低劑量組、PMS高劑量組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶水平明顯降低(P<0.01)；與陽性組比較，除模型組外，其他各組黃嘌呤氧化酶水平差異均無顯著性，見Tab 2。

Tab 2 Effects of different groups of drugs on liver XOD level

2.3 各組藥物對高尿酸血癥小鼠IL-1β、TNF-α的影響與正常組比較，模型組小鼠IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性組、PMS低、中、高劑量組小鼠IL-1β明顯降低(P<0.05或P<0.01)，陽性組、PMS中劑量組小鼠TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與陽性組比較，除模型組外，各組IL-1β、TNF-α水平差異均無顯著性，見Tab 3。

Tab 3 Effects of different groups of drugs on liver IL-1β and TNF-α levels in hyperuricemia

2.4 腎臟病理組織學檢測選取各組小鼠的腎組織進行病理切片檢查，結果如Fig 1所示，正常組腎小球結構清晰，腎小管上皮細胞結構正常，無明顯炎癥反應；模型組腎小管周圍間質有增生現象，有炎癥細胞發生聚集，腎小管出現擴張現象；陽性組腎小管的上皮細胞結構正常，炎癥細胞浸潤明顯減輕，腎小管擴張的情況有所改善；PMS低劑量組腎小管間質增生，有炎癥細胞聚集、腎小管出現擴張；PMS中劑量組腎小管部分間質增生，部分炎癥細胞聚集、部分腎小管擴張有所改善；PMS高劑量組炎癥細胞浸潤明顯減輕，部分間質輕微增生，少量炎癥細胞聚集、腎小管擴張有所改善，圖中箭頭指出主要炎癥部位。

Fig 1 Renal tissue pathological sections of each drug group(×400)A:Normal;B:Model;C:Allopurinol;D:PMS-L (15 mg·kg-1);E:PMS-M (30 mg·kg-1);F:PMS-H (60 mg·kg-1)

2.5 大車前苷對高尿酸血癥小鼠TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3信號通路及腎臟尿酸轉運蛋白的影響如Fig 2所示，小鼠肝臟組織中，與正常組比較，模型組中的TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白表達水平明顯上調(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，陽性組、PMS低、中、高劑量組中的TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白表達水平明顯下調(P<0.05或P<0.01)。小鼠腎臟組織中，與正常組比較，模型組中的GLUT9、URAT1蛋白表達水平明顯上調，OAT1蛋白表達水平明顯下調(P<0.01)；與模型組比較，陽性組、PMS低、中、高劑量組中的GLUT9蛋白表達水平明顯下調(P<0.05),OAT1蛋白表達水平明顯上調(P<0.01)，與陽性組比較，PMS低劑量組中的NF-κB、IL-1β、OAT1蛋白表達水平明顯上調(P<0.05或P<0.01)，PMS中劑量組中的OAT1蛋白表達水平明顯上調(P<0.01)，PMS高劑量組中的NLRP3、IL-1β蛋白表達水平明顯下調(P<0.01)、OAT1蛋白表達水平明顯上調(P<0.01)。

Fig 2 Expression of TLR4,TLR2,NLRP3,NF-κB,MyD88,and IL-1β proteins in liver tissues and GLUT9,URAT1,and OAT1 proteins in kidney tissues of mice in each groupA:Normal;B:Model;C:Allopurinol;D:PMS-L(15 mg·kg-1);E:PMS-M(30 mg·kg-1);F:PMS-H(60 mg·kg-1);#P<0.05,##P<0.01 vs normal;*P<0.05,**P<0.01 vs model.ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs Allopurinol.

3 討論

目前，國內外學者主要通過促進尿酸的排泄和抑制尿酸生成兩個方面對治療痛風做了大有裨益的研究。尿酸生成量異常增加會導致HUA，尿酸的排泄主要經過腎臟組織，當尿素氮水平升高時，通常反應腎臟功能出現損傷，尿酸的排泄也會受到一定的影響[11]。腺苷脫氨酶在腺苷平衡及嘌呤代謝過程中具有關鍵作用，可以間接調控尿酸的生成。當腺苷脫氨酶活性增強時會造成尿酸的合成速度加快；相反，腺苷脫氨酶活性降低時可減少尿酸的生成[12]。尿酸主要是由于黃嘌呤與次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶催化而產生，則黃嘌呤氧化酶直接影響尿酸的生成[13]，此外，尿酸水平的升高會引起多種炎癥因子的改變，經治療后，尿酸水平降低，炎癥因子也逐漸恢復正常[14]。

目前認為，TLR-NLRP3信號通路和尿酸轉運蛋白在痛風方面發揮重要作用。研究發現調控腎臟尿酸轉運體可增加尿酸的排泄[15]，“TLR/MyD88/NF-κB”信號通路系統和NLRP3信號通路是機體防御疾病的重要通路之一，其可以識別病原體相關模式從而介導非特異性免疫和獲得性免疫而參與炎癥、免疫等多種疾病的發生。其中，TLRs和MyD88對急性痛風性炎癥反應過程中是必需的[16]，尿酸鈉結晶可同時激活TLRs、IL-1R，然后與MyD88結合成復合物并活化相關激酶，使NF-κB等激活并轉移至細胞核內后啟動一系列炎性因子、趨化因子、粘附因子(如IL-1β、TNF-α等)的轉錄和表達[17]；此外，NLRP3蛋白和caspase-1之間的連接體是凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)，研究發現，NLRP3蛋白與ASC相互作用，可刺激caspase-1，形成炎性復合體，誘導其下游產物caspase-1、IL-1β、TNF-α的釋放，TLRs/MyD88/NF-κB信號通路與NLRP3炎性體可協同促進IL-1β的表達，加速炎癥反應[18]。

本研究在此基礎上基于TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3信號通路及腎臟尿酸轉運體的變化，研究PMS抗HUA作用機制，結果顯示：PMS中、高劑量組能使小鼠尿酸水平降低(P<0.05)；PMS各劑量組均能明顯下調小鼠血清中尿素氮、腺苷脫氨酶水平及小鼠肝組織中黃嘌呤氧化酶水平(P<0.05或P<0.01)，表明PMS可通過下調尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶表達水平及小鼠肝組織中黃嘌呤氧化酶活性改善小鼠HUA；此外，PMS各劑量組小鼠血清中IL-1β明顯降低(P<0.05或P<0.01)，PMS中劑量組小鼠血清中TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。表明PMS可以通過抑制IL-1β、TNF-α水平改善小鼠HUA。本實驗還釆用Western blot檢測HUA小鼠腎臟組織GLUT9、URAT1、OAT1蛋白的表達與肝臟組織TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白的表達，結果顯示PMS各劑量組均能明顯降低小鼠肝臟中TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β水平(P<0.05或P<0.01)；PMS各劑量組均能明顯降低小鼠腎臟中GLUT9水平(P<0.05),可明顯升高OAT1水平(P<0.01)，結果表明PMS可通過降低腎組織尿酸轉運體GLUT9水平、升高OAT1水平、下調TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3信號通路中TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白表達水平而起到降尿酸作用。

綜上所述，PMS對OA誘導的急性HUA小鼠會產生一定保護作用，其發揮作用的分子機制與調節腎臟尿酸轉運體和TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3炎癥通路密切相關。