GEO芯片分析聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討雷公藤治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子機(jī)制

鄒孟龍，黃曉燕，陳雅璐，寧 芯

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性復(fù)發(fā)性直腸及結(jié)腸炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等，發(fā)病機(jī)制通常被認(rèn)為與腸道菌群失調(diào)、免疫反應(yīng)紊亂等密切相關(guān)[1]。在臨床實(shí)踐中，UC常規(guī)治療依賴于氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物。然而，長期的西藥治療不僅給患者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且治療后的患者仍有較高的復(fù)發(fā)率、甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。研究表明，長期應(yīng)用磺胺嘧啶治療UC會引起男性低精子血癥和女性不孕；糖皮質(zhì)激素的使用也會導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂[2]。因此，探索UC新治療策略是十分必要的。

雷公藤最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其有大毒，故多為外用。臨床實(shí)踐中，小劑量雷公藤內(nèi)服對免疫性疾病療效獨(dú)特，已成為療效最確切的一味中藥，幾乎沒有類似的中藥可以代替[3-4]。研究表明，中藥雷公藤可以調(diào)節(jié)腸道菌群，恢復(fù)菌群多樣性，從而治療UC[3]；雷公藤多苷減少自由基生成、增強(qiáng)抗氧化能力，重新建立氧化還原平衡，抑制結(jié)腸炎癥[5]；雷公藤內(nèi)酯醇可以干預(yù)腫瘤壞死因子信號通路，抑制UC的炎癥反應(yīng)[6]；雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)初級膽汁酸生物合成、脯氨酸的代謝等途徑干預(yù)UC的進(jìn)展[7]。總而言之，雷公藤對于UC的治療具有顯著作用。然而，因其毒性較大，易引起藥源性不良反應(yīng)，這成為限制其在臨床上廣泛應(yīng)用的主要原因。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析雷公藤治療UC的活性成分、作用靶點(diǎn)、生物功能及信號通路，旨在為藥物活性成分的提取提供參考，從而降低藥物毒性。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/index.php，Version 2.3)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/，更新至2021年4月30日)；Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GEO數(shù)據(jù)庫)；STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/，Version 11.0)；Bioconductor平臺(http：//www.bioconductor.org/，Version 3.11)；R語言(x64 4.0.3)；Cytoscape軟件(Version 3.8.0)；Perl語言(ActivePerl 5.30)；PyMOL軟件(v2.4.0)；Auto Dock Tools軟件(1.5.6)；ChemBio3D Ultra 軟件(14.0)。

1.2 雷公藤活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的篩選條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到雷公藤的活性成分。運(yùn)用Perl語言結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫中已認(rèn)證的人類基因?qū)ψ饔冒悬c(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化，將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)為基因名稱。

1.3 雷公藤“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選得到的雷公藤活性成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建雷公藤“活性成分-藥物靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)。借助cytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥８鶕?jù)拓?fù)渲笜?biāo)Betweenness centrality(BC)、Degree centrality(DC)的中位值篩選得到雷公藤“活性成分-藥物靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)。

1.4 UC差異基因的篩選基因數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE38713芯片。該芯片數(shù)據(jù)包含13例健康受試者和15例活動性UC患者的結(jié)腸黏膜組織基因表達(dá)量，以健康受試者和活性UC患者基因差異倍數(shù)的絕對值(|log FC|)≥1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)分析基因數(shù)據(jù)的差異性。

1.5 雷公藤治療UC“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析將雷公藤作用靶點(diǎn)基因與UC差異基因進(jìn)行取交集，并繪制Venn圖；運(yùn)用Perl語言將交集基因映射出相對應(yīng)的活性成分，建立雷公藤“活性成分-疾病靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫；借助Cytoscape軟件繪制可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)拓?fù)渲笜?biāo)BC、DC的中位值得到雷公藤治療UC“活性成分-疾病靶點(diǎn)”的核心網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化分析將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出該網(wǎng)絡(luò)的tsv文件。將得到的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。同樣地，根據(jù)拓?fù)渲笜?biāo)BC、DC的中位值篩選得到雷公藤治療UC的主要靶點(diǎn)。

1.7 富集分析運(yùn)用R語言插件RSQLite和Bioconductor平臺數(shù)據(jù)包org.Hs.eg.db對基因進(jìn)行編碼，再借助 R 語言插件colorspace、stringi及Bioconductor平臺的 DOSE、clusterProfiler、pathview數(shù)據(jù)包進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析。GO富集分析是從生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3 個(gè)部分對基因靶點(diǎn)進(jìn)行作用機(jī)制注釋，根據(jù)P值對每個(gè)部分排名前10的條目進(jìn)行分析。KEGG富集分析是對靶點(diǎn)所參與的信號通路進(jìn)行注釋，根據(jù)P值選取排名前30的條目進(jìn)行分析，若條目不足30條，則對所有條目進(jìn)行分析。

1.8 分子對接將1.3項(xiàng)與1.5項(xiàng)篩選的活性成分取交集，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載交集活性成分的“mol2”格式文件，導(dǎo)入ChemBio3D Ultra軟件中計(jì)算最小自由能，得到活性成分(小分子配體)的PDB格式文件；將1.5項(xiàng)與1.6項(xiàng)篩選的靶點(diǎn)取交集，通過PDB數(shù)據(jù)庫下載交集靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，文件選擇“PDB”格式，然后將文件導(dǎo)入PyMol軟件中進(jìn)行去水、加氫、刪除配體、調(diào)整電荷等處理，導(dǎo)出蛋白晶體(大分子受體)的PDB格式文件。借助Auto Dock Tools軟件將小分子配體和大分子受體的PDB格式文件轉(zhuǎn)為PDBQT格式文件，并設(shè)置分子對接的活性口袋，然后通過Auto Dock Vina軟件完成分子對接。利用PyMol軟件繪制對接結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得雷公藤活性成分144個(gè)，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為篩選條件，獲得活性成分51個(gè)，將活性成分的對應(yīng)靶點(diǎn)與Uniprot數(shù)據(jù)庫中已認(rèn)證的人類基因靶點(diǎn)相互映射，發(fā)現(xiàn)33個(gè)活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)為非人類作用靶點(diǎn)，故剔除。最終得到28個(gè)活性成分(見Tab 1)，對應(yīng)132個(gè)作用靶點(diǎn)。

Tab 1 Active ingredients of tripterygium wilfordii

2.2 雷公藤“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建借助Perl語言將“2.1”項(xiàng)得到的28個(gè)活性成分和132個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行映射，映射結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建雷公藤“活性成分-藥物靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)。得到160個(gè)節(jié)點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)表示雷公藤活性成分和藥物靶點(diǎn))，418條邊(邊表示活性成分與藥物靶點(diǎn)之間的相互作用)。借助cytoCNA插件計(jì)算可視化網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)渲笜?biāo)BC值和DC值，選擇大于BC中位值且大于DC中位值的節(jié)點(diǎn)，提取并建立新可視化網(wǎng)絡(luò)，獲得雷公藤“活性成分-藥物靶點(diǎn)”的核心網(wǎng)絡(luò),見Fig 1。

2.3 疾病差異表達(dá)基因的篩選借助R語言對GSE38713芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并分析，以|log FC|≥1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行探針的篩選，得到健康受試者和UC患者差異表達(dá)基因1 355個(gè)，其中在UC患者結(jié)腸組織中上調(diào)基因796個(gè)，下調(diào)基因559個(gè)。

2.4 雷公藤治療UC“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析將雷公藤作用靶點(diǎn)基因(藥物)與UC差異表達(dá)基因(疾病)取交集，得到31個(gè)交集基因，見Fig 2。運(yùn)用Perl語言將交集基因映射出相對應(yīng)的活性成分，建立雷公藤治療UC“活性成分-疾病靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫，借助Cytoscape軟件構(gòu)建可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，得到55個(gè)節(jié)點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)表示雷公藤活性成分和疾病靶點(diǎn))，87條邊(邊表示活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用)。同樣運(yùn)用cytoCNA插件計(jì)算BC和DC值，根據(jù)中位值進(jìn)行篩選，提取雷公藤“活性成分-疾病靶點(diǎn)”的核心網(wǎng)絡(luò)，見Fig 3。

Fig 1 Core network of “active ingredient-drug targets”of tripterygium wilfordiiNotes:In the visualized diagram,the larger the node was,the redder the color was,and then the node was more important.Smaller nodes,more yellow color,the opposite.Figures 3 and 4 below were the same.

Fig 2 Venn diagram of intersection of drug and disease

Fig 3 Core network of “active ingredient-disease targets”of tripterygium glycosides in treatment of UC

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化分析將31個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出該網(wǎng)絡(luò)的tsv文件。將tsv文件導(dǎo)入Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，得到31個(gè)節(jié)點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)表示疾病靶點(diǎn))，174條邊(邊表示靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用)。通過Cytoscape軟件按上述篩選條件提取核心網(wǎng)絡(luò)，見Fig 4。

Fig 4 PPI core network

2.6 富集分析運(yùn)用R語言對31個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，設(shè)置P<0.05，共得到GO富集分析功能條目988條，KEGG相關(guān)通路40條。

2.6.1GO功能富集分析 在988條生物學(xué)功能條目中，包含BP條目884條，涉及脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)、血管生成的調(diào)節(jié)等；CC條目22條，涉及質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、膜微區(qū)等；MF條目82條，涉及病毒受體活性、外源性蛋白結(jié)合、血紅素結(jié)合等。根據(jù)P值列舉各類排名前10的生物學(xué)功能條目，見Fig 5。

Fig 5 GO function enrichment analysis bar chartNotes:The abscissa indicated the enrichment number of target points;The ordinate represented the biological function;Color represented the p value,and the smaller the p value,the redder the color,and vice versa.

2.6.2KEGG通路富集分析 在40條KEGG通路富集中，涉及NF-κB信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、瘧疾、TNF信號通路等。根據(jù)P值列舉排名前30的相關(guān)通路，見Fig 6。

2.7 分子對接由“活性成分-藥物靶點(diǎn)”的核心網(wǎng)絡(luò)可知，MOL000422、MOL0005828、MOL003231、MOL000358、MOL003229等成分在雷公藤發(fā)揮藥效中起重要作用。由“活性成分-疾病靶點(diǎn)”的核心網(wǎng)絡(luò)可知，MOL003199、MOL0005828、MOL000422、MOL003283、MOL003248等成分在雷公藤治療UC中發(fā)揮重要作用，且PTGS2、PTGS1、PPARG、NOS2、CA2等是雷公藤治療UC的重要靶點(diǎn)。由交集靶點(diǎn)的PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖可知，CXCL8、ICAM1、VCAM1、PTGS2、MMP9等為重要靶點(diǎn)。基于此，課題組綜合考慮藥物本身作用及藥物治療疾病作用兩方面，取Fig 1、Fig 3及Fig 4分析結(jié)果的交集作為雷公藤治療UC的核心成分及核心靶點(diǎn)。因此課題組認(rèn)為MOL003199、MOL005828、MOL000422、MOL003283、MOL003248、MOL000449、MOL003184、MOL003231、MOL003217、MOL000296、MOL003187等11個(gè)活性成分作用于PTGS2、PPARG等2個(gè)靶點(diǎn)是雷公藤治療UC的關(guān)鍵。將篩選得到的11個(gè)活性成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫中核對是否與PTGS2、PPARG靶點(diǎn)有直接作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOL003187與PTGS2、PPARG均無直接作用；MOL003248、MOL000449、MOL003184、MOL003231、MOL003217、MOL000296等6個(gè)活性成分與PPARG無直接作用，故通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載10個(gè)活性成分的2D結(jié)構(gòu)；通過PDB數(shù)據(jù)庫下載PTGS2的晶體結(jié)構(gòu)5F19及PPARG的晶體結(jié)構(gòu)3E00，借助Auto Dock Vina軟件完成14次分子對接進(jìn)行初步驗(yàn)證。分子對接是將篩選得到的10個(gè)活性成分(小分子)與2個(gè)蛋白晶體結(jié)構(gòu)(大分子)進(jìn)行模擬對接，計(jì)算結(jié)合能(Affinity)評價(jià)結(jié)合活性。Affinity越小表示分子對接結(jié)合效果越好，一般認(rèn)為，Affinity的絕對值≥7 kcal·mol-1表示結(jié)合活性較好，若Affinity的絕對值≥9 kcal·mol-1表示結(jié)合活性非常強(qiáng)[8-9]。對接結(jié)果見Fig 7(顏色越紅表示結(jié)合能越高，顏色越白則結(jié)合能越低，灰色表示活性成分與靶點(diǎn)無直接作用)。由圖可知，結(jié)合活性非常強(qiáng)的有MOL003199-PPARG、MOL003199-PTGS2、MOL000422-PTGS2、MOL003248-PTGS2等4個(gè)對接。借助PyMol軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化,見Fig 8。

Fig 6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysisNotes:The abscissa indicated the proportion of enriched target genes;The ordinate represented the path name;Bubble color indicated P value,the smaller the P value,the redder the color,the larger the P value,the bluer the color,and the bubble size indicated the enrichment number of target points.

Fig 7 Molecular docking result map

Fig 8 Docking diagram of core active ingredients and core target molecules

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從分子水平系統(tǒng)性觀察藥物活性成分、蛋白質(zhì)、基因和疾病之間的相互作用關(guān)系。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建雷公藤治療UC的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。拓?fù)渲笜?biāo)BC是指某一結(jié)點(diǎn)作為其它兩個(gè)結(jié)點(diǎn)之間最短路的橋梁的次數(shù)；DC是網(wǎng)絡(luò)分析中描述節(jié)點(diǎn)中心性最直接的度量指標(biāo)，值越高則表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要[10]。因此，我們借助拓?fù)渲笜?biāo)BC、DC對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選得到核心網(wǎng)絡(luò)。這有助于從雷公藤多成分、多靶點(diǎn)的藥物療效篩選出核心，為進(jìn)一步研究提供參考方向，為藥物的開發(fā)提供新思路，以滿足臨床治療UC的需求。

本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤治療UC的主要靶點(diǎn)有PTGS2、PPARG等。PTGS2(又稱COX-2)是一種可誘導(dǎo)酶，介導(dǎo)前列腺素的合成，在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物通過使重組人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子磷酸化并增強(qiáng)其與COX-2啟動子結(jié)合，從而激活COX-2轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Thelper-17細(xì)胞在結(jié)腸上皮募集而加劇UC進(jìn)展[11]。不僅如此，在炎癥過程中，前列腺素E2(PGE2)/前列腺素E受體2(EP2)信號通路與TNF-α信號通路協(xié)同作用以放大TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，形成COX-2/PGE2/EP2信號的正反饋回路，該回路一方面繼續(xù)加劇PG介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，另一方面通過在中性粒細(xì)胞之間形成自擴(kuò)增環(huán)，使參與炎癥的活躍細(xì)胞群交替反應(yīng)[12]。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPARG)屬于核激素受體超家族成員。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在UC患者的結(jié)腸粘膜中，PPARG信使RNA表達(dá)受損則伴隨著相應(yīng)的炎癥因子(如NF-κB)表達(dá)增強(qiáng)[13]。而且，PPARG已被證明是5-氨基水楊酸在UC中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的關(guān)鍵受體[14]。因此，PPAR-γ激動劑可能是UC治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

通過節(jié)點(diǎn)特征值參數(shù)的篩選，發(fā)現(xiàn)雷公藤作用于UC的主要活性成分有MOL003199(5,8-Dihydroxy-7-(4-hydroxy-5-methyl-coumarin-3)-coumarin)、MOL000422(Kaempferol)、MOL003248(Triptonoterpene)等。5,8-Dihydroxy-7-(4-hydroxy-5-methyl-coumarin-3)-coumarin是含香豆素類化合物，目前相關(guān)研究較少，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其作用于UC核心靶點(diǎn)均具有非常強(qiáng)的活性，且TSMSP數(shù)據(jù)庫中顯示與該化合物相關(guān)的中藥只有雷公藤，因此其可能是雷公藤發(fā)揮治療UC的特征性成分。Kaempferol是一種天然類固醇。研究表明[15]，Kaempferol降低UC模型小鼠血清一氧化氮和PGE2的表達(dá)水平、抑制結(jié)腸黏膜血清髓過氧化酶活性、促進(jìn)杯狀細(xì)胞分泌黏液，從而改善腸黏膜的受損狀態(tài)。Bian等[16]則認(rèn)為Kaempferol抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路的傳導(dǎo)是治療腸道炎癥的關(guān)鍵。眾所周知，Wnt信號通路沿著腸隱窩-絨毛軸梯度傳導(dǎo)，在腸隱窩底部活性最高，維護(hù)腸黏膜屏障功能[17]。Sharma等[18]研究表明Kaempferol通過調(diào)節(jié)Axin蛋白的活性，穩(wěn)定Wnt信號通路的傳導(dǎo)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子β-Catenin核表達(dá)，這可能是Kaempferol干預(yù)UC的途徑之一。Triptonoterpene(雷酚萜)是雷公藤的代表性藥物之一，同樣在TCMSP數(shù)據(jù)庫中與其相關(guān)的中藥僅有雷公藤。目前雷公藤治療UC的研究多聚焦于雷公藤多苷[5]、雷公藤內(nèi)酯醇[6]、雷公藤甲素[7]等，而對于本研究得到的核心成分研究較少，因此，本研究結(jié)果可為下一步探究提供思路。

GO富集分析顯示，生物過程多與脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)、血管生成的調(diào)節(jié)有關(guān)，且多發(fā)生于質(zhì)膜外側(cè)、膜筏等區(qū)域；分子功能主要包括病毒受體活性、外源性蛋白結(jié)合、血紅素結(jié)合等。KEGG信號通路富集結(jié)果表明，雷公藤治療UC與NF-κB、TNF等信號通路密切相關(guān)。富集分析結(jié)果在上述成分-靶點(diǎn)作用闡述中均有所體現(xiàn)，這再次證明了本研究借助拓?fù)渲笜?biāo)BC、DC篩選核心網(wǎng)絡(luò)的可靠性。

綜上所述，雷公藤中的5,8-Dihydroxy-7-(4-hydroxy-5-methyl-coumarin-3)-coumarin、Kaempferol、Triptonoterpene等主要活性成分可能通過參與NF-κB、TNF等信號通路作用于PTGS2、PPARG等疾病靶點(diǎn)在脂多糖反應(yīng)、血管生成等生物進(jìn)程發(fā)揮外源性蛋白結(jié)合等生物功能，從而具有治療UC的效用。