基于生物信息學探討丹參酮ⅡA治療潰瘍性結腸炎及其機制

吳小倩，黃偉芳，孔德松，周偉康，樊志敏

(1.南京中醫藥大學醫學院，整合醫學學院,江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬南京市中醫院中醫藥現代化與大數據研究中心，3.南京中醫藥大學附屬南京市中醫院肛腸科，江蘇 南京 210001)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)最早出現于19世紀中期，是一種病因尚不明確的腸道的非特異性慢性炎癥病，其病程漫長且反復發作，嚴重影響著人們的生活質量[1]。目前對其仍沒有有效的治療手段，逐年上升的發病率和高達50%死亡率，讓其成為消化系統的主要疾病之一。已有很多研究指出，炎癥是腸道疾病誘發的基礎，如：炎性腸病、腸易激綜合征、結直腸癌等[2]。結腸黏膜屏障的受損、腸道菌群失調與炎癥方面之間也是相互作用的，腸黏膜屏障的破壞可導致微生物易位，誘發炎癥。腸道穩態的破壞，又會導致不可控的腸黏膜反應，誘發細胞因子與氧自由基釋放，引發炎性因子風暴[3]。因此，維護機體內炎癥因子的平衡狀態，阻斷級聯放大的炎癥反應是防治腸道疾病的重要策略。

丹參SalviamiltiorrhizaBge是傳統中藥，唇形科植物丹參的根及根莖，具有活血調經、祛瘀止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。在臨床研究中，丹參因其莖葉中豐富的酚酸類成分與丹參酮類成分已被證實具有抗炎作用[4]。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)在丹參中含量較高，是其主要有效成分之一，具有較強的生理活性和藥理作用，具有天然抗氧化、抗腫瘤、抗炎除菌和神經保護等作用[5-6]。但是，目前對Tan ⅡA治療UC的作用機制研究較少，有待進一步深入探究。考慮到中藥成分與其功能的復雜性，生物信息學為其確定靶標和靶點提供了便捷。故本文先通過生物信息學，在分子的水平上，從靶點和信號傳導通路預測治療UC的可能性作用機制，再通過建立DSS小鼠模型，研究Tan ⅡA對UC的治療作用及其作用機制，為Tan ⅡA用于UC的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只C57BL/6J小鼠(20±2)g，雄性，SPF級，購于江蘇省南京市江寧區青龍山動物繁殖中心(6-8周)，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心，溫度(20-25)℃，濕度40%左右，每12 h明暗交替循環飼養。所有動物實驗按照南京中醫藥大學動物倫理委員會相關規定執行。

1.2 藥物與試劑丹參酮ⅡA(純度98%，上海純優，貨號：P0019)；葡聚糖硫酸鈉(MW:36000-50000，MP Biomedicals，貨號：216011050)；糞便隱血試劑定性檢測試劑盒(雷根生物，貨號：TC0511)；ELISA試劑盒：TNF-α、IL-1β、IL-6(金霖生物科技發展有限公司，貨號：JL30030、JL30027、JL30044)；Abcam公司：兔多克隆抗體COX2(貨號：ab41762)；兔多克隆抗體INOS(貨號：ab15323)；兔多克隆抗體TNF-α(貨號：ab66579)；兔抗PPARγ多克隆抗體(貨號：ab41762)；兔抗p-IκBa單克隆抗體(貨號：ab32518)；鼠抗△9 dehydrogenase單克隆抗體(貨號：ab110330)；甲醛溶液、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、0.9%氯化鈉注射液(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 儀器電子天平(上海佑科公司)、顯微鏡及圖像分析系統(德國徠卡公司)、手動切片機(美國Thermo公司)、包埋機(美國Thermo公司)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、低溫高速離心機(美國Sigma公司)、全波長酶標儀(美國Thermo公司)、-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)、JJ-2B勻漿機(金壇市環宇科學儀器廠)、電熱恒溫水槽(上海銳析儀器設備有限公司)、Leica ASP300S全自動真空組織脫水機。

1.4 生物信息學分析

1.4.1人群驗證 運用GEO數據庫中的GSE95095數據集，下載UC基因組數據。24個患者的炎癥位置的腸道組織以及非炎癥的腸道組織，組成一一配對的48個腸道組織標本，然后進行差異基因表達強度檢測，篩選在組織中的差異性表達基因。再使用Limma線性擬合方式進行配對樣本的炎癥過程的差異基因分析，以logFC與P值作為篩選條件，所篩選出的基因被視為明顯差異表達基因。

1.4.2靶點通路富集分析 DAVID數據庫是整合了生物學數據和分析工具的公開數據庫，可對基因和通路進行功能注釋。對所有差異基因進行GO與KEGG分析，GO富集分析是對差異表達基因(DEGs)進行細胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)這3個方面分析。KEGG通路富集分析，是闡明DEGs的基因功能和參與的細胞信號通路，然后以FDR法(FDR<0.05)對P值進行了測試和校正，最終設定閾值P<0.05，獲得具有統計學意義的信號通路。并以上述通路中的預測靶標、作用通路聯系Tan ⅡA的抗炎作用，構建可行性通路。

1.5 小鼠藥效實驗驗證

1.5.1造模與給藥 參考文獻[7]，隨機抽取50只雄性小鼠C57BL/6J，分為5組：正常對照組(Normal)、模型組(Model)、Tan ⅡA低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組自由飲水，其余各組飲水為4%的葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液，飲水和造模劑每2天更換一次，以防變質，保持清潔。正常組和模型組腹腔注射等體積的0.5% CMC-Na溶液，Tan ⅡA組腹腔注射低劑量組20 mg·kg-1、中劑量40 mg·kg-1、高劑量組60 mg·kg-1，從造模d 1開始連續7 d給藥，每天1次。

1.5.2一般情況與疾病活動指數(DAI)的觀測[8]造模期間每天監測食物與水的攝入、體質量、小鼠精神情況、有無死亡、觀察大便性狀(腹瀉、稀便、血便)并進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分，DAI=(體質量下降分數+糞便性狀分數+隱血分數)/3。小鼠結腸炎DAI具體評分標準見Tab 1。

Tab 1 DAI scoring criteria

1.5.3取材 造模開始后d 8，末次給藥后禁食不禁水12 h，頸椎脫臼法處死小鼠，摘取眼球法取血，將收集了血液的EP管置于冰上，靜置2 h以上，4 ℃，1 500 r·min-1，離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。從回盲腸交界處到直腸遠端區域解剖其結腸，PBS沖洗去除糞便，分離出完整的結腸。取相同部位10%福爾馬林溶液固定，其余組織-80 ℃凍存備用。

1.5.4蘇木精-伊紅染色(HE)病理觀察 用10%甲醛固定，48 h后，石蠟包埋、切片4 μm，60 ℃烘烤1 h，脫蠟至水：二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)各10 min，梯度乙醇脫水各5 min；雙蒸水沖洗10 min；蘇木素染色2-3 min，流水沖洗多余染料，鹽酸酒精分化數秒后流水沖洗，伊紅染色2 min，蒸餾水稍洗、上行梯度酒精脫水各1-2 min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)透明各2 min；封片、鏡檢，觀察小鼠結腸黏膜組織形態學變化并評分，評分標準參照Obermeier等[9]制定的標準。

1.5.5ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子 血液離心取上清液檢測，將樣品與標準品加入96孔板中并按說明書加入相應試劑，37 ℃孵育30 min，拍板、洗板5次，加入酶標試劑，再同樣操作，加入顯色液，37 ℃避光顯色15 min。加入終止液，于15 min內450 mm波長測量各孔OD值并處理數據。

1.5.6免疫組化檢測 NF-κB和PPARγ 取病變結腸組織，用4%多聚甲醛固定。石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。抗原修復后加入一抗，孵育后加入二抗，用DAB染色、脫水、透明等方法干燥、密封切片。根據組織切片進行組織學評分。

1.5.7Western blot檢測結腸Δ9去飽和脫氫酶、PPARγ和IκBα的表達 取結腸組織，于冰上剪碎，加入RIPA裂解液，提取蛋白后離心取上清，采用BCA蛋白定量法測定各樣本蛋白濃度，調整各樣本蛋白濃度煮沸變性，電泳1.5-2 h，然后轉至PVDF膜，接著加入封閉液室溫封閉60 min，加入對應稀釋好的一抗、二抗。一抗根據說明書比例稀釋，4 ℃孵育過夜，TBS洗膜后加入稀釋好的二抗37 ℃搖床1 h，再TBS洗膜，最后加ECL顯影、定影、掃描。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值分析。

2 結果

2.1 UC患者差異基因分析Limma線性擬合方式，進行配對樣本的炎癥過程的差異基因分析，比較得出數據中炎癥組與非炎癥組明顯影響和改變的差異表達基因共有170個，分別對炎癥組與非炎癥組數據進行GEO2R分析，以|log2FC|>1以及FDR<0.05為篩選差異基因的標準，其中logFC≥1.5代表基因表達上調，logFC≤-1.5代表基因表達下調，結果其中有109個基因表達上調，30個基因表達下調，根據所篩選出的差異基因作火山圖(Fig 1)。其中紅色代表基因表達上調，綠代表基因表達下調。

Fig 1 Volcano map of DRGs

2.2 GO富集分析和KEGG通路分析采用DAVID數據庫對預測的差異基因進行GO功能注釋和KEGG通路分析。可得GO富集分析分為3類：CC、MF和BP。其主要富集的CC是細胞頂端、頂端質膜、基地側膜、血小板α顆粒等區；分子功能是參與有機陰離子轉運、細胞外結構、基質組織、血管發育的正向調節等生物學過程。將基因GO本體條目按P值進行排序，分別選取CC、MF和BP的前10繪制氣泡圖(Fig 2A-C)。Pathway分析靶點基因主要富集參與到的5條最關鍵的信號通路(P<0.005))分別為蛋白質的消化與吸收途徑、視黃醇途徑、PI3K-Akt通路、青少年后期糖尿病醇途徑與與亞油酸途徑(Fig 3)。

Fig 2 Bubble chart of GO function analysisA:Cell composition;B:Molecular function;C:Biological process.

Fig 3 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.3 小鼠一般狀態的影響建立DSS誘導的UC小鼠模型，進行初步研究評估Tan ⅡA對UC小鼠的治療作用。實驗期間，正常對照組小鼠體重增加、飲食大便均正常。其余各組小鼠在飲用4% DSS后，造模組小鼠3 d后出現精神不振、體質量下降，d 4普遍出現稀便、肉眼血便。Tan ⅡA給藥組從d 4開始也出現精神不佳、食欲下降、稀便，但各項指標與模型組相比較好。如Tab 2所示，與對照組相比，模型組的DAI評分為(3.41±0.52)明顯上升(P<0.001)。給藥之后，Tan ⅡA各組的DAI評分分別為3.27±0.45、2.9±0.24和2.45±0.28明顯低于模型組(P<0.05)，Tan ⅡA高劑量組與低、中劑量相比評分更低，說明Tan ⅡA對UC小鼠具有一定的治療作用。

Tab 2 Score of disease activity index in each

2.4 結腸組織病理學觀察通過HE染色進一步分析Tan ⅡA對小鼠結腸黏膜組織病理學改變的影響。正常組對照組小鼠結腸上皮屏障完整，腺體排列規則，未見水腫、潰瘍，無炎癥細胞浸潤，隱窩結構完整。與正常對照組相比，模型組炎癥累及腸壁全層，上皮破壞、結構不清，隱窩消失，單核、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。Tan ⅡA治療后呈劑量依賴性地減輕DSS誘導的病理改變(Fig 4A)。此外，組織學分析顯示Tan ⅡA改善了結腸黏膜的損傷，評分均低于模型組(Fig 4B)。

Fig 4 Effect of Tan ⅡA on pathological morphology of colon tissues in UC mice (× 200)A:HE staining (× 200).B:Histopathological score of colon in IBD mice by Tan ⅡA.##P<0.01 vs Normal；**P<0.01vs Model.

2.5 對結腸炎性細胞因子表達的影響采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的水平。結果如Fig 5所示，正常對照組小鼠血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均值分別為467、203、65 ng·L-1，模型組各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯上升,分別

達到了711、248和121 ng·L-1，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，Tan ⅡA給藥后TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯降低，且與低劑量組相比，高劑量組下降趨勢更為明顯。表明Tan ⅡA對DSS誘導的小鼠UC具有一定的改善作用，能減少促炎細胞因子的釋放且具有劑量依賴性。

2.6 對小鼠結腸組織的免疫調控機制的影響NF-κB p65在正常組織中無或者表達低，在UC活動期表達較高。如Fig 6A所示，無活性時NF-κB p65一般表達于胞質中，有活性后轉移到細胞核中。與正常對照組相比，模型組結腸組織細胞核中NF-κB p65表達量高，Tan ⅡA給藥組表達量較模型組低，高劑量細胞核中數量尤為明顯。經統計學分析，空白對照組、模型組和Tan ⅡA給藥組小鼠結腸組織中NF-κB之間的表達差異都具有統計學意義(P<0.05)(Fig 6B)。使用Western blot方法檢測了各組小鼠結腸組織中的IκBα磷酸化(p-IκBα)的蛋白的表達量。研究發現如Fig 7所示，與正常對照組相比，模型組p-IκBα的表達量明顯增加，Tan ⅡA治療后p-IκBα表達量下降，表明Tan ⅡA可抑制NF-κB信號通路激活，從而起到抗炎作用。

Fig 5 Effect of Tan ⅡA on TNF-α,IL-1β and IL-6 in serum of UC mice#P<0.05，##P<0.01 vs Normal；*P<0.05，**P<0.01 vs Model.

有報道顯示，在飲食中添加CLA可以預防腸道炎癥，所以我們用Western blot方法檢測了結腸組織中的Δ9去飽和脫氫酶，在體內CLA可通過Δ9脫氫酶由內源途徑產生[7]，結果如Fig 7所示，隨著Tan ⅡA給藥量的增加，Δ9去飽和脫氫酶的表達增加，說明了Tan ⅡA含量越多，CLA的含量也隨之上升。CLA誘導的腸上皮細胞凋亡又屬于PPARγ依懶型[10]，在CLA刺激下，PPARγ能夠誘導抗炎基因的轉錄[11]。我們接著對UC小鼠結腸組織進行PPARγ免疫組化方法，PPARγ在正常組織中表達含量低或者無，有活性時主要表達于結腸黏膜上皮細胞的細胞核中，并與病變的嚴重度相關，炎癥越重，表達量越低。反之，相反。結果如Fig 6所示，在空白對照組中PPARγ表達量高，模型組結腸組織細胞核中PPARγ表達量低，Tan ⅡA給藥組表達量較模型組高，且高劑量細胞核中數量尤為明顯。Fig 7結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠結腸組織中的PPARγ的蛋白水平明顯降低，給藥低、中、高組PPARγ的蛋白水平上升，高劑量組較為明顯。說明對NF-κB信號通路的作用可能是由通過CLA與PPARγ介導的。

Fig 6 Effect of Tan ⅡA on NF-κB activation and PPARγ expression in colonic tissues of UC mice#P<0.05 vs Normal；*P<0.05，**P<0.01 vs Model.

Fig 7 Effect of Tan ⅡA on expression of Δ9 dehydrogenase and PPARγ protein in colon tissues of UC miceA:The band diagram detected by Western blot.B:Comparison of the gray value of Western blot results,with β-actin as the internal reference.##P<0.01 vs Normal；*P<0.05，**P<0.001 vs Model.

3 討論

UC是一種自身免疫性疾病，病因尚未明確，目前多認為與遺傳、感染、免疫失調、環境等因素相關。基于與UC相關的途徑與調節的靶標，我們先從GEO數據庫下載UC患者的表達數據庫GSE95095，利用GPL14951進行差異基因表達強度檢測，然后對差異基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發現了這些靶基因主要富集的通路，并且這些通路都有可能參與了抑制炎癥調控。近年來，對于細胞內重要信號轉導通路PI3K-Akt在腸道炎癥反應過程發揮的作用研究較多，但亞油酸對腸道炎癥反應的有益作用報道較少，所以我們基于上面的生物信息學探討CLA與宿主抗炎機制之間的關系。

CLA的同分異構體有20多種，通過對免疫細胞、免疫細胞因子、免疫應答和過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ途徑的影響調節宿主的免疫功能，從而延緩動物以及人類機體免疫力的衰退[12]。研究發現，CLA誘導的腸上皮細胞凋亡屬于PPARγ依賴型。CLA能增加脂肪細胞、骨骼肌、結腸黏膜和巨噬細胞中PPARγ的表達和活性[13]。CLA對促炎癥細胞因子的調控與活化型的核轉錄因子PPARγ有關，PPARγ在抑制炎癥因子生成方面起很重要的作用[14-15]。在UC中，PPARγ可以通過抑制誘導抑制因子IκB激酶的產生抑制NF-κB活性，進而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等相關炎癥因子的表達，減輕UC炎癥反應。CLA與PPARγ的配體過氧化物酶體增殖物的生理特性結構與結構生理特性都比較相似，這有可能是CLA激活PPARγ實現抗炎機制的關鍵因素。所以，探索CLA與PPARγ介導的調控下游NF-κB信號通路為靶點的治療藥物，將為UC治療提供新思路與方法。

本研究采用4%的DSS法建立的UC小鼠模型，觀察不同劑量的Tan ⅡA對于小鼠一般狀態、炎癥因子及腸道黏膜損傷的改善作用，以及是否可以通過CLA和PPARγ介導的抗炎機制調控。研究發現Tan ⅡA確實緩解了小鼠體質量減輕、糞便出血等情況，結腸組織病理切片表現出Tan ⅡA對于DSS小鼠可保護結腸黏膜、減少炎性細胞浸潤。驗證了Tan ⅡA確實可以改善小鼠UC狀況。接著，我們進一步探討了Tan ⅡA在結腸細胞中CLA激活PPARγ實現抗炎途徑所涉及的機制。與正常對照組相比，模型組CLA和PPARγ蛋白表達量下降，p-IκBα蛋白表達明顯升高，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平也高于正常組，但治療7 d后，Tan ⅡA處理將其趨勢逆轉，CLA和PPARγ蛋白表達量上升，p-IκBα、TNF-α、IL-6、IL-1β水平下降，有明顯差異(P<0.05)。

據此，本研究可以推斷Tan ⅡA對DSS誘導的UC疾病具有保護作用，且其作用機制可能與CLA激活PPARγ基因，阻斷下游NF-κB信號通路，下調炎癥因子的表達，上調腸黏膜屏障保護因子的蛋白表達有關。本課題組接下來將通過體外實驗和代謝組學對其藥效與通路機制做進一步研究，證明其有效性，為開發新藥提供安全、有效的藥理學證據。