四君子湯含藥血清對IEC-6細胞增殖及多胺調控NPM及p53表達的影響

涂小華，楊光勇，楊 欣，徐萌萌，鄧 穎，何光志，王 慧

(貴州中醫藥大學 1.機能實驗室，2.微生物教研室，貴州 貴陽 550025)

胃腸黏膜屏障對機體有很重要的保護作用，胃酸、非甾體類抗炎藥、氧化應激、炎癥等均可引起胃腸黏膜損傷。黏膜損傷后，機體將啟動黏膜快速修復過程，包括黏膜損傷早期修復(細胞遷移)，細胞增殖、黏膜重構等過程，該過程受到多個信號通路的調控，多胺(包括腐胺、精脒及精胺)為其重要調控因素之一。眾多研究表明，不管是生理還是病理情況下，多胺對胃腸道黏膜生長過程中是必不可少的，減少細胞內多胺將抑制上皮細胞增殖并破壞上皮黏膜的完整性[1-2]。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)是一種細胞核仁的磷蛋白，對細胞增殖有重要的調控作用；p53基因主要調控細胞周期，細胞凋亡等過程；多胺可通過下調NPM及p53表達而促進小腸上皮細胞增殖[3-5]。

四君子湯為臨床常用方，源于宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、白術、茯苓、甘草等比例組方，具有益氣健脾之功效，該方為臨床治療脾虛證的代表方劑。目前研究發現，四君子湯可調控多胺信號通路鈣離子上下游指標而促進小腸上皮細胞遷移[6-8]，可影響多胺及黏膜屏障相關蛋白而發揮防治胃腸黏膜損傷作用[9]。上皮細胞增殖是黏膜損傷后修復的重要環節之一，四君子湯可上調c-Myc而促進小腸上皮細胞增殖[10]，但其促進上皮細胞增殖的具體作用機制尚未明確，本研究通過觀察四君子湯對IEC-6細胞增殖、細胞內多胺含量、多胺信號通路NPM、p53 mRNA及蛋白表達的影響，探討四君子湯促進小腸上皮細胞增殖的作用機制，為研究四君子湯修復胃腸黏膜損傷作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 IEC-6細胞(大鼠小腸上皮細胞)，購自上海中喬新舟生物科技有限公司(生產單位：美國Sciencell公司)，貨號：ZQ0783。

1.1.2實驗動物 健康SD大鼠20只，♀♂各半，體質量(200±20)g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，實驗動物質量合格證號：11072622011001638，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0014，所有動物實驗研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則，實驗動物飼養在避光、通風環境中，實驗溫度(22±2)℃，相對濕度45%-50%，飼料由長沙市天勤生物技術有限公司提供。適應性喂養1 周后用于制備含藥血清。

1.1.3藥物及試劑 人參、茯苓、炒白術、炙甘草等實驗用中藥材均購自北京同仁堂(貴陽分店)；胎牛血清(批號：1606F，澳大利亞Bovogen Biological公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(批號：20200211)，高糖DMEM(批號：20200310)，胰酶(批號：20191030)，均為賽澳美細胞技術(北京)有限公司產品；腐胺(putrescine，PUT，貨號：D13208-25G)，精脒(spermidine，SPD，貨號：S2626-1G)，均為美國sigma公司產品；α-二氟甲基鳥氨酸(α-Difluoromethylornithine，DFMO，貨號：288500-25MG-M，德國Calbiochem公司)，MTT(批號：1015D058)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：PC0020)，彩虹180廣譜蛋白Marker(批號：1120B021)，均為北京索萊寶科技有限公司產品；RIPA裂解液(貨號：P0013B)，PMSF(貨號：ST506)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(貨號：P0012A)，5×蛋白上樣緩沖液(貨號：P0285)，均為碧云天生物技術公司產品；ECL化學發光液(貨號：1705060，美國 Bio-Rad公司)；β-actin一抗(貨號：4970S)，GAPDH一抗(貨號：5174S)，p53一抗(貨號：2524S)，NPM一抗(貨號：3542S)，均為美國CST公司產品；山羊抗兔二抗(批號：GR3321256-7，英國abcam公司)；RNA提取試劑盒(貨號：9767)，逆轉錄試劑盒(批號：AJ92011A)，PCR熒光染料(批號：AJE1687A)，寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.1.4主要儀器 RE-5203旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；3111 CO2培養箱，Multiskan go酶標儀，Nanodrop lite超微量紫外可見光分光光度計，Multifuge X1R離心機，均為美國Thermo Scientific公司產品；N-EVAP-111氮吹儀(美國 Organomation公司)；ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent 1260高效液相色譜系統，均為美國Agilent technologies公司產品；DMil倒置相差顯微鏡(德國徠卡公司)；TC-96/G/H(b)梯度PCR儀(杭州博日科技有限公司)；CFX96熒光定量PCR儀，Power PacTMBasic電泳儀，ChemicDocTMXRS+凝膠成像儀，均為美國 Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1四君子湯含藥血清的制備 人參、茯苓、炙甘草、炒白術各75 g，藥材打粉(不宜過細)，12倍量水浸泡2 h后文火煎煮提取2 h，紗布過濾，收集濾液；同法再煎煮1次；2次濾液合并后減壓濃縮至含生藥量為1 mg·L-1的四君子湯水提液。將SD大鼠隨機分為四君子湯組(灌胃四君子湯水提液，給藥劑量13 g生藥·kg-1·d-1)及空白組(灌胃等體積生理鹽水)，每組10只。每天灌胃2次，連續4 d，d 4一次性灌胃全天劑量，給藥2 h后乙醚麻醉，腹主動脈采血，血樣靜置2 h后，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，混勻同組血清，56 ℃滅活30 min，以0.22 μm 微孔濾膜過濾后分裝，得空白血清及四君子湯含藥血清，-20 ℃低溫冰箱保存備用。臨用前以含0.5%胎牛血清的DMEM將空白血清稀釋成10%(體積分數)空白血清培養基，將SJZDS分別稀釋成5%、10%及20%四君子湯含藥血清培養基備用。

1.2.2IEC-6細胞培養及MTT法檢測細胞增殖 參照文獻方法[6]進行細胞培養，IEC-6細胞以濃度為5×107個·L-1接種于96孔板，每孔200 μL，培養基為5%胎牛血清的DMEM，培養24 h，棄培養液，參照文獻方法[11-12]加入無血清的DMEM血清饑餓24 h后，空白對照組每孔加入200 μL含10%空白血清培養基，陽性對照組加入200 μL含PUT(終濃度10 μmol·L-1)的10%空白血清培養基，SJZDS低、中、高劑量組分別加入200 μL 5%、10%及20% SJZDS含藥血清培養基；DFMO負荷實驗中，除空白對照組外，其余各組均在上述給藥方法基礎上加入2.5 mmol·L-1的DFMO，DFMO組加入含DFMO(終濃度2.5 mmol·L-1)的10%空白血清培養基；分別培養24、48及72 h，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)，37 ℃避光孵育4 h后，棄培養液，各孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標儀490 nm 波長檢測吸光度A值，計算細胞增殖率，細胞增殖率/%=實驗組A值/對照組A值×100%。每組5-6個復孔，重復3次獨立實驗。

1.2.3HPLC法檢測細胞內多胺(PUT及SPD)含量 IEC-6細胞以濃度為8×107個·L-1接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“1.2.2”(培養基體積為2.5 mL)，每組6個復孔，2個復孔合并為一個樣品；給藥24 h后，參照文獻方法[7]收集細胞內多胺并將其衍生化，按其色譜條件檢測細胞內PUT及SPD含量，多胺含量=細胞樣品中多胺含量(nmol)/細胞樣品中細胞數。重復3次獨立實驗。

1.2.4熒光定量PCR法檢測NPM及p53 mRNA表達 IEC-6細胞以濃度為8×107個·L-1接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“1.2.2”(培養基體積為2.5 mL)；給藥培養48 h后，RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，立即檢測RNA純度及濃度，采用逆轉錄試劑盒(去基因組DNA)將各組樣品逆轉錄為cDNA，其反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA樣品加入熒光染料及引物后，在熒光定量PCR儀上進行PCR反應，反應條件為：25 μL反應體系，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。結果以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算NPM及p53 mRNA相對表達量。每組3個復孔，重復3次獨立實驗。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence for qPCR

1.2.5Western blot 法檢測NPM及p53蛋白表達 IEC-6細胞以濃度為8×107個·L-1接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“1.2.2”(培養基體積為2.5 mL)；給藥培養48 h后，刮取細胞并用RIPA裂解液(臨用前加PMSF)提取各組細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，蛋白樣品(加入上樣緩沖液)沸水浴5 min制備蛋白印跡上樣樣品并進行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結束后，將膠及PVDF膜制備“三明治”，放入電轉液中恒流300 mA轉膜90 min；根據PVDF膜上的marker切膜，將膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h；分別用β-actin一抗，NPM一抗4 ℃孵育過夜(p53蛋白表達同法操作)，洗膜3次，加入山羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜3次；將PVDF膜浸沒在ECL發光液中5 min后置于Chemic DocTMXRS+成像儀上成像，以β-actin或GAPDH作為內參，Image Lab軟件分析NPM，p53蛋白條帶灰度值。每組3個復孔，重復3次獨立實驗。

2 結果

2.1 SJZDS對正常或DFMO負荷下IEC-6細胞增殖的影響無負荷下實驗結果見Fig 1，與空白對照組比較，給藥24 h后，PUT及10%，20% SJZDS均可增加細胞增殖率(P<0.01)，給藥48 h、72 h后，PUT及5%、10%、20% SJZDS均可增加細胞增殖率(P<0.01)，提示SJZDS對正常小腸上皮細胞增殖有促進作用，其藥效與PUT相似。DFMO負荷實驗結果見Fig 2，與空白對照組比較，給藥48、72 h后，多胺合成抑制劑DFMO可降低細胞增殖率(P<0.01)，表明多胺減少可抑制IEC-6細胞增殖；與DFMO組比較，給藥48 h后，PUT及5%、10%、20% SJZDS均可逆轉DFMO所致的細胞增殖率降低(P<0.01)；給藥72 h后，PUT及10%、20% SJZDS均可逆轉DFMO所致的細胞增殖率降低(P<0.01)，提示SJZDS可促進小腸上皮細胞增殖，該作用與影響多胺有關。

2.2 SJZDS對正常或DFMO負荷下PUT及SPD含量的影響無負荷下實驗結果見Tab 2及Fig 3，與空白對照組比較，PUT及5%、10%、20%SJZDS可提高PUT含量(P<0.01)，PUT及10%、20% SJZDS可增加SPD含量(P<0.05，P<0.01)，提示SJZDS可增加正常小腸上皮細胞內PUT及SPD含量，其藥效與PUT相似。DFMO負荷實驗結果見Tab 3及Fig 4，與空白對照組比較，多胺合成抑制劑DFMO可降低PUT及SPD含量(P<0.01)，表明多胺合成抑制劑可降低細胞內多胺含量；與DFMO組比較，PUT及10%、20% SJZDS可逆轉DFMO所致的PUT及SPD含量的減少(P<0.01)，提示SJZDS可提高小腸上皮細胞內多胺含量。

Tab 2 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and n=3)

Tab 3 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and SPD loaded by n=3)

Fig 1 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on **P<0.01 vs Control group

Fig 2 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on IEC-6 cell proliferation loaded by n=6)**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs DFMO group

Fig 3 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and n=3)

Fig 4 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and SPD loaded by n=3)

2.3 SJZDS對正常或DFMO負荷下NPM mRNA及蛋白表達的影響Fig 5結果顯示，與空白對照組比較，PUT，5%、10%、20% SJZDS均可降低NPM mRNA及蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。Fig 6結果顯示，與空白對照組比較，DFMO可提高NPM mRNA及蛋白表達(P<0.01)；與DFMO組比較，PUT，5%、10%、20% SJZDS可逆轉DFMO所致的NPM mRNA及蛋白表達升高(P<0.01)。提示SJZDS可降低NPM mRNA及蛋白表達，且該作用與影響多胺有關。

2.4 SJZDS對正常或DFMO負荷下p53 mRNA及蛋白表達的影響Fig 7結果顯示，與空白對照組比較，PUT，10%、20% SJZDS可降低p53 mRNA表達(P<0.01)，PUT，5%、10%、20% SJZDS可抑制p53蛋白表達(P<0.01)。Fig 8結果顯示，與空白對照組比較，DFMO可提高p53 mRNA及蛋白表達(P<0.01)；與DFMO組比較，PUT，5%、10%、20% SJZDS可逆轉DFMO所致的p53 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)。提示SJZDS可降低p53 mRNA及蛋白表達，且該作用與影響多胺有關。

Fig 5 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of NPM mRNA and n=3)1：Control;2：PUT;3：5%SJZDS;4：10%SJZDS;5：20%SJZDS；*P<0.01,**P<0.01 vs Control group

Fig 6 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of NPM mRNA and protein loaded by n=3)1：Control;2：5%SJZDS+DFMO;3：10%SJZDS+DFMO;4：20%SJZDS+DFMO;5：PUT+DFMO;6：DFMO；**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs DFMO group

Fig 7 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of p53 mRNA and n=3)1：Control;2：PUT;3：5%SJZDS;4：10%SJZDS;5：20%SJZDS；**P<0.01 vs Control group

Fig 8 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of p53 mRNA and protein loaded by n=3)1：Control;2：5%SJZDS+DFMO;3：10%SJZDS+DFMO;4：20%SJZDS+DFMO;5：PUT+DFMO;6：DFMO；**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs DFMO group

3 討論

四君子湯為治療脾虛證的經典方劑，臨床常用其加減方或結合其他藥物治療脾虛證相關的黏膜病變，該方可顯著改善患者的脾胃功能，緩解消化性潰瘍患者癥狀，促進病灶愈合[13-14]。四君子湯上述功效的發揮與其修復胃腸黏膜損傷的作用有關。有研究表明，四君子湯可通過促進上皮細胞遷移而修復胃腸黏膜損傷，其作用機制與影響多胺信號通路有關[7]，該通路是維持胃腸黏膜完整性的重要信號通路之一。本研究從上皮細胞增殖角度探討四君子湯的作用機制，給藥24、48及72 h后，SJZDS可促進正常小腸上皮細胞(非分化、非瘤性)增殖，該作用與文獻[10]結果相似；多胺合成抑制劑DFMO可阻斷鳥氨酸脫羧酶(多胺合成限速酶)活性，降低多胺的生物合成，DFMO對IEC-6細胞增殖具有明顯的抑制作用，給藥48 h及72 h后，SJZDS可逆轉DFMO對細胞增殖的抑制作用，表明四君子湯促進小腸上皮細胞增殖的作用可能與影響多胺有關。為進一步探討在細胞增殖過程中四君子湯與多胺信號通路的關系，本研究采用高效液相色譜法檢測給藥24 h后細胞內多胺含量，結果發現SJZDS可提高細胞內PUT及SPD含量，且還可逆轉DFMO所致的PUT及SPD含量的降低，進一步表明四君子湯促進小腸上皮細胞增殖作用與影響多胺有關。

在轉錄水平，p53蛋白對影響細胞生長及細胞凋亡的相關基因有重要的調控作用，多胺對轉錄后p53基因的表達有負調控作用，p53蛋白下調可促進小腸黏膜生長。多胺減少可穩定p53 mRNA而提高p53 mRNA及蛋白的表達，此外，多胺合成減少還可抑制Mdm2的表達，減少Mdm2與p53復合物的形成而降低p53蛋白的降解，p53蛋白表達升高可提高細胞周期阻滯基因(如p21)轉錄而抑制上皮細胞增殖，最終抑制小腸黏膜的生長[3,5,15]。本研究結果發現，SJZDS不僅可降低p53 mRNA及蛋白表達，還可逆轉DFMO所致的p53 mRNA及蛋白表達升高，提示四君子湯可負調控p53 mRNA及蛋白的表達，該作用與影響多胺有關。NPM是一個多功能磷蛋白，具有組裝核糖體及轉運蛋白的作用，通過與細胞內不同蛋白結合而調控這些蛋白的活性。天然多胺類對小腸上皮細胞生長有重要調控作用。已有研究表明，NPM為小腸上皮細胞增殖的負調控因子之一，多胺合成減少可提高NPM基因及蛋白表達，NPM與p53相互作用而增加NPM/p53復合物的形成，最終穩定p53表達而抑制腸上皮細胞增殖。此外，靶向NPM的小分子干擾RNA抑制NPM表達后，p53蛋白穩定性下降，最終抑制p21活性而促進上皮細胞增殖[4]。本研究結果發現，SJZDS對NPM mRNA及蛋白表達具有抑制作用，且可逆轉多胺合成抑制劑DFMO所致的NPM mRNA及蛋白表達增加，提示四君子湯對NPM有負調控作用，該作用與影響多胺有關。

有研究采用HPLC-MS分析四君子湯水煎液及其含藥血清化學成分，發現四君子湯水煎液及其含藥血清中的有效成分主要來源于人參及甘草，人參主要以原型化學成分，甘草則以水解產物的形式存在于在血液中[16]。結合前期研究結果，四君子湯多糖可通過影響多胺而促進胃腸黏膜損傷修復[7]，四君子湯多糖、人參及甘草的主要有效成分等可能是四君子湯促進小腸上皮細胞增殖的藥效物質基礎，有待進一步明確。另有研究表明，甘草可通過影響HuR介導的轉錄后調控，降低p21及p53 mRNA的穩定性而促進IEC-6細胞增殖[17]。RNA結合蛋白HuR是轉錄后調節中的重要調節因子之一，對許多基因的mRNA穩定性有調節作用，復方四君子湯下調p53 mRNA表達的作用是否與影響HuR介導的轉錄后調控，降低p53 mRNA穩定性有關，有待進一步探討。

綜上所述，四君子湯可通過增加細胞內多胺含量，下調生長相關基因NPM及p53表達而促進小腸上皮細胞增殖；多胺合成抑制劑DFMO則降低細胞內多胺含量，上調NPM及p53 mRNA及蛋白表達而抑制小腸上皮細胞增殖，四君子湯可逆轉DFMO的作用。結合前期研究表明，四君子湯可通過促進小腸上皮細胞遷移及細胞增殖而修復胃腸黏膜損傷，多胺信號通路為其作用靶點之一。后續考慮考察四君子湯對多胺信號通路NPM與p53相互作用及其他生長相關基因的調控機制及藥效物質基礎，并結合胃腸黏膜損傷動物實驗，進一步探討四君子湯促進胃腸黏膜上皮細胞增殖的作用機制，為研究四君子湯修復胃腸黏膜損傷作用提供參考。