基于腫瘤標志物OATP1B3的近紅外熒光染色用于鑒別口腔鱗癌

崔娟娟 馬曉楠

摘要：目前口腔癌的診斷方法均存在一定的局限性，臨床上仍需一種快速、準確、簡便的方法來診斷口腔部位病變細胞，而近紅外熒光染色有可能填補這一空白。通過分析數據庫中腫瘤特異性親和的近紅外熒光染料IR-783的轉運體OATP1B3在癌癥組織中表達特征，發現轉運體的高表達與口腔鱗癌患者生存期縮短相關。另外，體外試驗中IR-783染色容易區分出口腔鱗癌細胞與非癌細胞，提示OATP1B3有可能作為口腔癌診斷的標志物，而IR-783染色可以成為潛在的口腔癌診斷方法。

關鍵詞：口腔癌;近紅外熒光;OATP1B3

頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分。口腔頜面部惡性腫瘤發病率僅次于鼻咽癌，居頭頸部惡性腫瘤的第2位。每年新發口腔癌患者數約占新發頭頸部腫瘤的15%。口腔癌是一種高度致死的癌癥，致死率接近50%[1]。目前，口腔癌的診斷方法主要有兩種，即影像學檢查和細胞學/組織活檢，但臨床上仍需要一種快速、準確、簡便的方法來診斷口腔部位病變細胞。所以考慮應用一些對癌細胞有特異親和力的熒光染料，借助顯微成像系統進行診斷，形成一種全新、安全、高效的高分辨率實時影像學診斷系統。小分子近紅外熒光染料IR-783是一種水溶性陽離子七甲川花菁染料，以前被用來測量血流量和心輸出量，如今，人們注意到了它的一種重要特性：IR-783很容易穿透生物膜結構，可以特異性地富集于癌細胞的線粒體中。IR-783在癌細胞線粒體中的富集依賴于有機陰離子轉運體OATP1B3（由SLCO1B3基因編碼）。OATP1B3在許多種類的腫瘤細胞中都有高表達，但具體表達水平和表達機制均未知。本研究將通過分析數據庫中OATP1B3在癌癥組織中表達特征，分析OATP1B3是否適合作為口腔癌的診斷標志物，并考察IR-783是否富集于腫瘤細胞中，從而使IR783染色成為潛在的口腔癌診斷方法。現報道如下：

1材料與方法

基因表達資料交互分析：GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）在線程序被用于分析和比較TCGA及GTEx數據，得到SLCO1B3在不同組織的分布情況。線箱圖用于比較多種腫瘤與對應的正常組織中SLCO1B3表達差異是否有統計學意義，|log2FC|臨界值設定為1，P值臨界值設定為0.01，其余為默認值。

生存分析：GEPIA的生存分析（包括了總體生存期與無病生存期）模塊中用時序檢驗（Log-rank test）作為假設檢驗（hypothesis test）。SLCO1B3表達的中位數作為臨界值。

近紅外熒光染料染色及熒光觀察：細胞數相同的人口腔鱗癌細胞CAL-27與人胚胎腎細胞HEK293共培養于DMEM培養基中（含有10% FBS，1%青霉素-鏈霉素雙抗）。細胞鋪板8h后，在培養基中加入10 nmol/L IR-783，37℃避光孵育10 min，棄去培養基后用冷的PBS洗3次，加入新鮮培養基后40倍物鏡相差及熒光顯微鏡觀察并拍照（Olympus IX71，熒光激發波長630 nm，發射波長780 nm）。

2結果

2.1 OATP1B3在腫瘤和正常組織中的表達差異

基因表達資料交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis， GEPIA）被用于比較TCGA及GTEx數據，得出OATP1B3（SLCO1B3）在正常組織或器官和對應的腫瘤組織中的表達差異及差異是否有統計學意義。正常人體內，OATP1B3僅在肝臟和膽囊高表達，而在其他組織中幾乎觀察不到表達。但在小腸以外的其他消化系統腫瘤中存在表達水平升高的情況（圖1A、B）。相反，與正常肝臟和膽囊相比，在肝癌和膽囊癌組織中OATP1B3表達量卻降低（圖1B）。對表達差異進行統計分析后發現，只有結腸腺癌、食道癌、頭頸癌、肝癌和膽囊癌中SLCO1B3的表達與正常組織對照相比有顯著性差異（P<0.01，圖1C、D）。提示SLCO1B3的表達可能與這五種癌癥發生與進展相關。

2.2 SLCO1B3表達與癌癥病人生存期相關性分析

為了明確SLCO1B3的表達對這幾種癌癥病人預后的影響，GEPIA被用于分析基因表達與患者生存期之間的相關性。泛癌分析結果顯示SLCO1B3的高表達患者明顯有著更短的總體生存期與無病生存期（圖2A、B）。而結腸腺癌、食道癌、頭頸鱗癌患者SLCO1B3的高表達與生存期縮短顯著相關（圖2C），尤其是頭頸鱗癌患者SLCO1B3的高表達意味著更差的預后（圖2D）。另外，肝癌和膽囊癌患者SLCO1B3的表達對總體生存期與無病生存期均無顯著性影響（圖2E、F）。以上結果提示SLCO1B3的表達對頭頸鱗癌患者預后影響較大。

2.3 OATP1B3介導的IR-783在口腔癌細胞中富集

作為頭頸部腫瘤重要的一類，口腔癌鱗細胞是否可以通過表達OATP1B3而富集近紅外熒光染料并無報道。為了觀察IR-783是否可以特異性染色口腔癌細胞，人口腔鱗癌細胞CAL-27與人胚胎腎細胞HEK293共培養，經IR-783染色后進行白光及近紅外熒光觀察。結果顯示IR-783在CAL-27細胞中特異性富集，而在HEK293細胞中幾乎沒有富集（圖3）。而CAL-27細胞紅外熒光信號很強烈（圖3B），293細胞幾乎不被紅外染料著色，很難將其與背景分開，兩種細胞染色對比度達到100：1。使用IR783，能夠清楚的區分兩種細胞。

3討論

根據已有文獻報道，IR-783可以在多種腫瘤細胞系及裸鼠的異體移植腫瘤中富集，顯示出其作為癌癥診斷試劑的價值，但哪些腫瘤可以富集IR-783并不清晰，限制了其應用。本研究從IR-783的轉運體OATP1B3的表達出發，明確了SLCO1B3基因在腫瘤與配對正常組織中表達的差異，及SLCO1B3高表達與患者生存期縮短的的相關性。在此基礎上證明了口腔鱗癌細胞易于富集IR-783，而這種近紅外熒光染料有成為口腔癌診斷試劑的潛力。

參考文獻

[1]趙友，周燁，崔笠，等.基于代謝組學的前列腺癌腫瘤標志物研究進展[J].腫瘤學雜志，2020，26（2）：78-82.