結直腸腺瘤癌變序列組織中ciRS-7 和miR-7 的表達水平及關系探討

李伊倩，譚嘉圣，張寶庭，陳毅斌

（東莞市松山湖中心醫院消化內科 廣東 東莞 523000）

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率，2012 年各惡性腫瘤發病率中，病死率位居第5 位[1]。近年來，隨著人口老齡化趨勢加劇，以及人們生活、工作等方式改變，結直腸癌的發病率逐年上升，并呈現出一定的年輕化趨勢，極大地威脅到了人們的健康乃至生命安全[2]。數據報道[3]顯示，進展期結直腸癌的5 年生存率為7%，而早期結直腸癌則高達92%。由此不難看出，若能夠早期診斷及治療，結直腸癌的預后會得到顯著的改善，然而從以往的研究來看，超過半數的結直腸癌患者確診時癌細胞已經發生轉移。至今，結直腸癌的發病機制仍不明確，早期診斷也無特效方法，結合當前醫學界對惡性腫瘤分子學機制的研究，探索結直腸癌發病的分子學機制，尋找無創的早期檢測結直腸癌發病的分子生物學對結直腸癌的早期診斷十分重要。為此，本研究納入20 例同時具有結直腸腺瘤及結直腸腺癌患者，針對環狀RNA 分子-7（ciRS-7）和微小RNAs-7（miR-7）的表達及其相關性進行分析，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

納入東莞市松山湖中心醫院2019 年7 月—2021 年6 月收集的20 例同時具有結直腸腺瘤及結直腸癌病例進行研究，均行電子結腸鏡檢查及活檢。男12 例（60.00%），女8 例（40.00%）；年齡35 ～75 歲，平均年齡（56.32±2.47）歲。所有患者的病例診斷均由2 名以上資深病理專家確診。以上標本均通過患者家屬的知情同意。納入標準：①同時具有結直腸腺瘤及結直腸癌患者；②診斷明確，且未經過放療、化療等抗腫瘤治療；③有完整的臨床病理資料。排除標準：①來源于其他部分的腫瘤發生結直腸轉移者；②術前已接受放化療或者生物治療者。

1.2 方法

采集癌旁正常腸黏膜、結直腸腺瘤、結直腸癌新鮮組織標本，取材過程中，每份組織標本均分為3 部分，其中2 部分離體后30 min 內保存于EP 管中，并迅速轉存于-80 ℃冰箱，用于提取總RNA；另1 部分送病理科進行病理診斷。

采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測組織標本中ciRS-7 和miR-7 的表達水平。（1）活檢新鮮冰凍標本總RNA 中提取：將標本從-80 ℃冰箱中取出，立即取組織塊約100 mg，轉入研磨器中，加入液氮后繼續研磨至粉狀，再加入1 mL TRIzol 充分混勻粉末，參照常規TRIzol RNA 方法取，提取后置于-80 ℃冰箱中保存。（2）PCR 反應：核酸蛋白檢測儀檢測RNA 濃度和純度并反轉錄成cDNA，合成的cDNA 置于-20 ℃冰箱中保存，適當稀釋后用于PCR 反應。參照PubMed 中基因序列，利用ABI 公司的Primer Express 軟件進行引物設計，由上海生物工程技術公司合成。ciRS-7 和miR-7 引物序列，見表1。

表1 ciRS-7 和miR-7 引物序列

1.3 統計學方法

2.結果

2.1 各組織標本中ciRS-7、miR-7 表達水平比較

ciRS-7 表達：結直腸癌和結直腸腺瘤表達水平高于癌旁正常腸黏膜，結直腸癌表達水平高于結直腸腺瘤，差異均有統計學意義（P＜0.05）；miR-7 表達：結直腸癌和結直腸腺瘤表達水平低于癌旁正常腸黏膜，結直腸癌表達水平低于結直腸腺瘤，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組織標本中ciRS-7、miR-7 表達水平比較（± s）

表2 各組織標本中ciRS-7、miR-7 表達水平比較（± s）

注：*與癌旁正常腸黏膜P ＜0.05，△與結直腸腺瘤P ＜0.05。

組織例數ciRS-7miR-7癌旁正常腸黏膜200.95±0.120.39±0.07結直腸腺瘤201.48±0.20*0.61±0.10*結直腸癌202.07±0.31*△1.02±0.18*△

2.2 各組織標本中ciRS-7、miR-7 表達的相關性

在各組織標本中，ciRS-7 和miR-7 的表達呈顯著負相關（P＜0.05），見表3。

表3 各組織標本中ciRS-7、miR-7 表達相關性

3.討論

結直腸癌的發病過程是漸進性的過程，其惡變途徑主要表現為“腺瘤→腺癌”，報道指出，超過2/3 的腺癌是由腺瘤進展而來[4]。但是，盡管臨床對結直腸癌的發病機制進行了深入探究，然而其癌變途徑和分子機制尚不明確。

CircRNA 廣泛存在與真核細胞中，是一種內源性非編碼新型RNA 分子，其不存在5’和3’末端，被RNA 外切酶破壞的可能性較低，與傳統線性RNA 相比，其穩定性更加突出，而上述特征的存在，也使其相較于miRNAs和非編碼長鏈RNA 作為生物學標志物應用在惡性腫瘤的早期診治中更為適合[5]。CiRS-7 是RAN 分子之一，形狀為環狀，其功能主要為miRNA 海綿、轉錄和轉錄后調節和與RNA 結合蛋白相互作用。但是國內有關CiRS-7 與結直腸癌相關內容的研究并不多見[6]。miRNAs 是非編碼RNA，有長19 ～23 個的核苷酸，參與了細胞的增殖、侵襲、轉移和凋亡[7]。RNA-7 是一種新型的腫瘤標志物，其在多種腫瘤中的表達均表現出下調，有研究指出其是惡性腫瘤預后不良的重要危險因素[8]。然而國內尚無miR-7在正常腸黏膜-結直腸腺瘤-腸癌序列癌變組織中表達方面的研究。本文結果顯示，結直腸癌、結直腸腺瘤、正常腸黏膜各組織標本中，CiRS-7 的表達水平逐漸下降，而miR-7 的表達水平則逐漸上升，差異有統計學意義（P＜0.05），說明了在結直腸腺瘤癌變序列組織中，的確存在CiRS-7、miR-7 異常表達的現象，其中CiRS-7表達上調，miR-7 下調。因此可以說明，CiRS-7、miR-7在結直腸癌的發生發展過程中發揮了一定的作用。進一步分析發現，CiRS-7、miR-7 的表達呈顯著負相關，差異有統計學意義（P＜0.05），提示二者相互負性調控關系。由此可以推測，在結直腸癌細胞中，CiRS-7 可抑制miR-7 的表達，其可能發揮出了miR-7 抑制劑的作用。由于國內相關報道并不多見，本研究盡管獲得上述研究結果，但仍有待深入探究并證實。

綜上所述，結直腸腺瘤癌變序列組織中，ciRS-7 表達上升，miR-7 表達下降，且二者之間呈顯著的負相關，提示ciRS-7 和miR-7 有望成為結直腸腺瘤及腺癌早發現、早診斷、早治療的分子生物學指標。