血清微小核糖核酸-599 與肝細胞肝癌TACE 治療預后的相關性

王 奕， 韓 濤， 張志強， 崔 剛， 廖 搴， 蔡恒烈

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第二大惡性腫瘤，嚴重危害著人們健康。 中國是HCC 的高發國家，發病人數約占全球HCC 患者總數的 55%［1］。 目前，盡管針對 HCC 的診斷及治療取得了一定進展， 但HCC 患者的5 年總生存率仍不足10%［2］。 有研究指出，對于相同腫瘤分期的 HCC，經肝動脈化療栓塞（transhepaticarterialchemoembolization，TACE）的治療效果存在一定差異［3］。因此，早期評價HCC 治療效果，不僅可節約醫療資源，還可達到精準治療的目的［3］。 文獻報道，微小核糖核酸-599（miR-599）參與了甲狀腺乳頭狀癌［4］、神經膠質瘤［5］和膀胱尿路上皮癌［6］等發病和進展過程，并與預后有關。此外，miR-599 還可調節HCC 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等過程［7-8］。 本研究選取 TACE 治療的 HCC患者作為研究對象， 分析miR-599 與預后的關系，以期為改善HCC 預后提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入 2016 年6 月至 2018 年 2 月在江西省萍鄉市人民醫院確診并接受治療的166 例HCC 患者，男 108 例，女 58 例；年齡為（62.2±4.7）歲，范圍為 48～70 歲。 Child-Pugh A 級 124 例，B 級 42 例；HBsAg 陽性 137 例，陰性 29 例；甲胎蛋白≤400 μg/L 69 例，＞400 μg/L 97 例；腫瘤單發 63 例，多發 103 例；腫瘤直徑≤5 cm 87 例，＞5 cm 79 例；腫瘤分期：Ⅰb期 16 例，Ⅱ期 70 例，Ⅲa 期 80 例；TACE 次數：1 次111 例，2 次 26 例，3 次 29 例；索拉非尼：接受 19 例，未接受 147 例；血管侵犯：有 80 例，無 86 例。 HCC診斷參照《原發性肝癌診療規范（2019 年版）》［9］，有典型的肝癌影像學表現，病灶＞2 cm 或肝占位性病灶經病理組織學或細胞學檢查證實。 納入標準：①年齡＜80 歲；②接受TACE 治療；③簽署了知情同意書。 排除標準：①Child-Pugh C 級；②臨床信息不完整；③合并其他惡性腫瘤；④合并血液系統疾病；⑤獲取血液樣本前接受了放化療、靶向治療或免疫治療等。

所有研究對象對研究內容知情同意，簽署知情同意書。 本研究經江西省萍鄉市人民醫院醫學倫理委員會批準（2016R-239KS）。

1.2 TACE 治療方案

術前檢查所有受試者血常規、尿常規、凝血功能等。 手術步驟：消毒、鋪巾，行局部麻醉，采用Seldinger 法由股動脈入路插入導管至腹腔動脈或肝總動脈，行血管造影檢查，明確癌組織的供血情況；將化療藥奧沙利鉑（江蘇奧賽康藥業股份有限公司，國藥準字：H20064296，100 mg/m2）和 5-氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業有限公司， 國藥準字：H31020593，500 mg/m2）稀釋，緩慢灌注至癌組織的供血動脈，用乳化充分的超液化碘油（煙臺魯銀藥業有限公司，國藥準字：H37022398）和阿霉素（瀚暉制藥有限公司，國藥準字：H33021980，40 mg/m2）的混懸液栓塞，注入明膠海綿顆粒［杭州艾力康醫藥科技有限公司，國食藥監械（準）字2014 第3771056 號］栓塞，直至癌組織供血動脈呈“干樹枝”狀；拔出導管和導管鞘，局部加壓止血。術后給予保肝、止吐等藥物治療，醫囑術后4 周復診，行CT 檢查，根據癌組織壞死情況制定后續治療方案，TACE 后腫瘤復發的患者，再次給予TACE 治療；TACE 治療無效的患者，聯合消融（本研究中不包含接受消融治療的患者）或靶向藥物。

1.3 miR-599 表達量檢測

實時熒光定量 PCR 檢測血清 miR-599 表達量［10］。抽取受試者TACE 術前1 d 和術后28 d 肘部靜脈血10 mL，離心后吸取上清液，置于 EP 管中，-80℃冰箱中保存。 實驗步驟：取凍存的血清，解凍后用TRIzol 試劑（日本 Takara 公司）提取總 RNA，用 752型紫外分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司）檢測RNA 純度； 用反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將 RNA 反轉錄為 cDNA；用 Q1600 型 PCR 儀（杭州柏恒科技有限公司）擴增產物，條件為95 ℃10 min，95 ℃ 60 s，35 個循環，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。miR-599 上游序列：5'-TAAGCTGACATGGGACAGG GAT- 3'， 下 游 序 列 ：5'- CTCCATATCGCACTTTA ATCTCTAACT-3'； 內參 U6 上游序列：5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3'， 下游序列：5'-ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'。 選取同期參加體檢的20 名年齡、性別與HCC 患者匹配的健康人的樣本作為對照，用2-DDct法計算HCC 患者血清中miR-599 的相對表達量。

1.4 隨訪

采用復診和電話隨訪方式獲取受試者3 年生存結局，于受試者出院后1 個月復診，此后每3～6個月隨訪 1 次， 末次隨訪時間為2021 年 2 月 23日，中位隨訪時間為36（6～36）個月。

1.5 統計學方法

應用SPSS 23.0 軟件包進行統計分析。 正態分布的計量資料以表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，TACE 前、后 miR-599 的相對表達量比較用重復測量方差分析；非正態分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，2 組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。計數資料以例數表示，組間比較采用χ2檢驗。用受試者工作特征（receiver operating characteristics，ROC）曲線下面積評價miR-599 診斷HCC 預后的價值。用Cox 回歸分析miR-599 與TACE 治療HCC預后的關系。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生存組和死亡組患者臨床特征比較

根據HCC 患者的3 年生存結局將其分為生存組113 例和死亡組53 例。 生存組和死亡組的年齡、性別構成、HBsAg、腫瘤數目和接受TACE 治療次數構成比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；生存組的 Child-Pugh A 級、AFP≤400 μg/L、腫瘤直徑≤5 cm、 腫瘤分期Ⅰb 期和接受索拉非尼治療的例數均高于死亡組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后，生存組和死亡組的年齡、 性別構成、Child-Pugh 分級、HBsAg、AFP、腫瘤數目、腫瘤直徑、腫瘤分期和接受TACE 治療次數比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。 見表 1。

表1 生存組和死亡組患者的臨床特征比較

2.2 生存組和死亡組患者miR-599 相對表達量比較

生存組和死亡組患者miR-599 相對表達量差異有統計學意義（F=66.799，P＜0.01），生存組術前、術后的miR-599 相對表達量均高于死亡組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；術前、術后的 miR-599 相對表達量差異有統計學意義（F=232.151，P＜0.01），生存組和死亡組的術后miR-599 相對表達量均較術前升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；生存結局和時間之間無交互作用（F=3.843，P=0.052）。 見表 2。

按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后，生存組和死亡組的miR-599 相對表達量差異有統計學意義（F=12.267，P=0.001），生存組術前、術后的 miR-599 相對表達量均高于死亡組， 差異均有統計學意義（P＜0.05）；術前、術后的 miR-599 相對表達量差異有統計學意義（F=37.369，P＜0.01），生存組和死亡組的術后miR-599 相對表達量均較術前升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；生存結局和時間之間無交互作用（F=1.258，P=0.269）。 見表 2。

表2 生存組和死亡組患者miR-599 相對表達量比較

2.3 miR-599 診斷HCC 預后的價值分析

術前miR-599 診斷HCC 預后的ROC 曲線下面積高于術后miR-599，差異有統計學意義（Z=2.603，P=0.009），見表 3。

按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后，術前miR-599 診斷 HCC 預后的ROC 曲線下面積高于術后miR-599，但差異無統計學意義（Z=0.961，P=0.337），見表 3。

表3 miR-599 診斷HCC 預后的價值分析

2.4 HCC 生存預后的Cox 回歸分析

將HCC 預后作為因變量，將年齡、性別、Child-Pugh 分級、HBsAg、AFP、腫瘤數目、腫瘤直徑、腫瘤分期、TACE 次數、 接受索拉非尼治療和術前miR-599 作為自變量，分別納入Cox 回歸分析，結果顯示Child-Pugh 分級、AFP、腫瘤直徑、腫瘤分期和術前miR-599 與 HCC 預后有關（P＜0.05）。 將 HCC 預后作為因變量，將Child-Pugh 分級、AFP、腫瘤直徑、腫瘤分期、 術前miR-599 和接受索拉非尼治療作為自變量（納入標準為單因素Cox 回歸分析的P＜0.10 或已知與HCC 生存預后有關），一并納入Cox 回歸分析， 結果顯示腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高是HCC 預后的獨立危險因素（P＜0.05），接受索拉非尼治療和術前miR-599 表達量高是HCC 預后的獨立保護因素（P＜0.05）。 見表 4。

表4 HCC 生存預后的Cox 回歸分析結果（傾向性評分匹配前）

按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后，將HCC預后作為因變量， 將年齡、 性別、Child-Pugh 分級、HBsAg、AFP、腫瘤數目、腫瘤直徑、腫瘤分期、TACE次數和術前miR-599 作為自變量（1∶1 傾向性評分匹配后不包含接受索拉非尼治療的患者）， 分別納入Cox 回歸分析，結果顯示術前miR-599 與HCC 預后有關（P＜0.05）。將HCC 預后作為因變量，將腫瘤數目、腫瘤分期和術前miR-599 作為自變量一并納入Cox 回歸分析， 結果顯示術前miR-599 表達量高是HCC 預后的獨立保護因素（P＜0.05）。 見表 5。

表5 HCC 生存預后的Cox 回歸分析結果（傾向性評分匹配后）

3 討論

目前，已有多數miRNA 被報道與HCC 預后有關，如 miR-542-3p、miR-139 和 miR-100-5p 等［11-13］。本研究主要分析血清miR-599 與TACE 治療HCC 預后的關系。 既往文獻報道，接受TACE 治療的HCC患者3 年生存率為72.12%［14］，本研究中接受 TACE治療的HCC 患者3 年生存率為68.07%， 存在一定差異，其原因可能與樣本量大小、腫瘤分期構成等有關。

為避免混雜因素影響統計分析結果的準確性，本研究采用最鄰近原則進行了1∶1 傾向性評分匹配，從生存組和死亡組中抽選臨床特征匹配的42 例患者進行比較。 結果顯示，生存組和死亡組患者術后miR-599 相對表達量均較術前升高， 提示miR-599相對表達量與TACE 治療有關； 且生存組術前、術后的miR-599 相對表達量均高于死亡組， 提示術前、術后的miR-599 相對表達量與TACE 治療HCC預后有關，是HCC 預后評估的潛在生物標志物。 本研究構建了術前、 術后的miR-599 診斷HCC 預后的ROC 曲線，結果顯示術前miR-599 診斷HCC 預后的ROC 曲線下面積高于術后miR-599，提示術前miR-599 診斷HCC 預后的價值較術后miR-599 高；按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后，雖術前和術后的miR-599 診斷HCC 預后的ROC 曲線下面積差異無統計學意義， 但術前miR-599 診斷HCC預后的ROC 曲線下面積高于術后miR-599，因此認為術前miR-599 對HCC 預后評估有一定價值。

本研究用Cox 回歸分析了HCC 預后的風險因素， 結果顯示術前miR-599 是HCC 生存預后的獨立保護因素；按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后， 結果亦顯示術前miR-599 表達量高仍是HCC預后的獨立保護因素。 推測其原因有以下兩點：一是過表達miR-599 可靶向MYC 抑制 HCC 細胞增殖、遷移和侵襲［7］；二是過表達 miR-599 可靶向富含絲氨酸/精氨酸剪接因子2 抑制HCC 細胞活力、遷移和侵襲，促進細胞周期停滯和凋亡［8］，miR-599 表達量與HCC 細胞的增殖、 凋亡、 侵襲和遷移等有關，進而可反映HCC 患者TACE 治療獲益。

既往研究結果顯示， 腫瘤直徑和腫瘤分期與HCC 生存預后獨立相關［15-16］。本研究結果也顯示，腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高是HCC 生存預后的獨立危險因素， 接受索拉非尼治療是HCC 生存預后的獨立保護因素，與上述報道結果一致。按1∶1 傾向性評分匹配（最鄰近原則）后，結果顯示腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高并非HCC 生存預后的獨立危險因素，推測該差異可能與傾向性評分匹配后樣本量小有關，后續還需增大樣本量，進一步進行分析。

綜上所述， 術前 miR-599 與 HCC 患者 TACE治療預后有關，其表達量低提示預后不良風險高。 本研究尚存在一定不足， 如僅分析了血清miR-599 與TACE 治療的HCC 患者預后的關系，未分析其與接受其他治療方案的HCC 患者預后的關系， 后續將開展大樣本、多中心研究進行分析，以充實本研究結論。