內質網應激在抗腫瘤治療中的作用及研究進展

王安琪，孫國平

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，安徽 合肥 230022)

內質網是蛋白質合成、折疊、加工、運輸及參與脂質代謝的重要場所，也是細胞內儲存Ca2+的主要場所。蛋白質折疊和分泌受損導致的未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網腔內積累，這種現象稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，并引發一系列的保護性級聯信號反應，稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。內質網跨膜蛋白肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)、蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)介導3條經典的UPR通路，在緩解ERS、維持細胞內環境穩態中發揮重要作用。通常情況下，這3個傳感器都通過與葡萄糖調節蛋白78 (glucose regulated protein 78，GRP78)結合保持非激活狀態，但腫瘤細胞往往處于缺血、缺氧、營養物質缺乏的腫瘤微環境中，大量的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網腔內積累，GRP78與未折疊蛋白結合，并與PERK、IRE1和ATF6解離，三條信號通路激活。ERS與腫瘤的發生發展、遷移侵襲、自噬耐藥、免疫逃逸[1]等密切相關。

未折疊蛋白反應是一種適應性反應，通過減少蛋白質的來源和增加蛋白質的去路減輕內質網負荷，恢復了細胞的穩態，這促進了腫瘤細胞的生存，使腫瘤惡性進展；但當過度激活的ERS超過癌細胞所能承受的閾值時，則會激活促凋亡途徑誘導癌細胞死亡。故ERS相關抗腫瘤治療可以通過兩種途徑：一是通過抑制UPR介導的促生存通路，二是通過誘導持續的ERS介導的促死亡通路。

Fig 1 Unfolded protein response signaling pathway

1 抑制UPR介導的促生存通路

1.1 靶向GRP78GRP78是一種主要的內質網分子伴侶，具有Ca2+結合和抗凋亡的特性。與正常組織相比，GRP78在肝癌、胃癌、乳腺癌、腎細胞癌、子宮內膜癌及惡性膠質瘤中的表達升高，GRP78表達與腫瘤耐藥、侵襲性增加和患者預后較差相關，抑制GRP78表達能明顯抑制腫瘤生長，增加腫瘤細胞對藥物的敏感性。例如，通過小干擾RNA(siRNA)抑制GRP78的表達增加了乳腺癌細胞的凋亡和對化療的敏感性，也恢復了耐藥乳腺癌細胞抗雌激素的敏感性[2]。GRP78最近被認為是癌癥治療的潛在靶點，體外實驗中靶向GRP78的抗體在非小細胞肺癌和膠質母細胞瘤的體內外均表現出抗腫瘤活性，并能增強放療療效[3]。GRP78在正常成人大腦中低水平表達，但在惡性膠質瘤標本和人類惡性膠質瘤細胞系中顯著升高，siRNA下調GRP78導致膠質瘤細胞生長放緩。HKH40A是WMC79的8-甲氧基類似物，是一種具有體外和體內抗腫瘤活性的合成藥物，HKH40A可以通過顯著降低不同來源的癌細胞株GRP78蛋白的水平從而發揮抗腫瘤活性作用。MAb159是一種抗GRP78單克隆抗體，可以特異性識別GRP78表面，觸發GRP78內吞，在體內定位于腫瘤而不是正常器官，MAb159在體內外均能抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞死亡。研究表明MAb159可以通過抑制PI3K信號通路，代償性激活MAPK通路，抑制腫瘤的生長和轉移[4]。癌細胞中GRP78還可定位于細胞表面，細胞表面GRP78在侵襲性、轉移性和耐化療的癌癥中優先過表達。GRP78在細胞表面的表達作為多種信號通路的受體，可能有很大的治療價值，讓治療性抗體治療成為可能。PAT-SM6就是一個例子，PAT-SM6是一種從胃癌患者中分離出來的自身抗體，該抗體可以針對GRP78的一種特殊亞型，在臨床前研究中發現PAT-SM6可以抑制胃癌異種移植瘤的生長。該抗體還可特異性誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡，而不影響正常細胞，在復發或難治性多發性骨髓瘤患者中PAT-SM6的單藥治療具有良好的耐受性和中度的臨床活性[5]。在黑色素瘤中，一項藥物安全性和耐受性的I期臨床試驗也為PAT-SM6的臨床應用及進一步開發提供了有力的支持。上述研究表明靶向GRP78的表達為治療癌癥提供了新思路。

1.2 靶向IRE1α-XBP1通路作為未折疊蛋白反應中最保守的信號通路，IRE1參與調控了腫瘤發生發展的各個階段，對IRE1通路嚴密調控可作為腫瘤治療的有效手段。X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)的活性形式為XBP1s，較高水平的XBP1s與更具侵襲性的乳腺腫瘤和較差的生存率相關，抑制IRE1α通過逆轉ERS和重塑腫瘤微環境與抗血管生成治療具有協同作用[6]。IRE1α表達缺失或siRNA抑制XBP1表達可抑制腫瘤增長以及減少腫瘤發生過程中的血管生成，使耐藥的人膠質母細胞瘤細胞對氧化應激敏感。

IRE1α的小分子抑制劑可能具有潛在的抗腫瘤作用。MKC8866是一種小分子IRE1α RNase特異性抑制劑，通過靶向癌細胞中的IRE1通路，從而抑制了三陰性乳腺癌中MYC過表達的腫瘤生長，另外MKC8866大大增強了多西紫杉醇化療的療效，導致MYC過表達腫瘤的快速消退[7]。同樣，在前列腺癌與橫紋肌肉瘤上也觀察到了MKC8866的抗腫瘤特性。Sheng等[8]研究表明MKC8866在多種小鼠臨床前模型中強烈抑制前列腺癌的生長，并與現有的抗前列腺癌藥物具有協同作用。在橫紋肌肉瘤細胞系中觀察到IRE1和PERK被激活，在加入IRE1 RNase抑制劑MKC8866或PERK抑制劑AMGEN44后，這種激活被減弱，抑制UPR可降低細胞活力、抑制細胞增殖及集落形成[9]。STF-083010是IRE1α核糖核酸內切酶抑制劑，可特異性阻斷IRE1α-XBP1信號通路。與非耐藥的乳腺癌細胞相比，耐藥的乳腺癌細胞XBP1在mRNA和蛋白水平上上調，STF-083010處理后重新建立了耐藥乳腺癌細胞對他莫西芬的敏感性，STF-083010和他莫西芬聯合治療可以顯著延緩異種移植乳腺腫瘤模型中乳腺癌的進展。在卵巢癌中STF-083010也通過激活caspase -12、-3和Bax/Bcl-2蛋白的表達，降低細胞增殖，誘導細胞凋亡[10]。STF-083010在多發性骨髓瘤中也具有抗腫瘤活性。另一種IRE1α核糖核酸內切酶結構域小分子抑制劑MKC3946，通過抑制XBP1的剪接，抑制了多發性骨髓瘤細胞的生長，并且增強了硼替佐米和17-AAG誘導的細胞凋亡。不同類型的IRE1α特異性抑制劑的抗腫瘤作用還在胰腺癌、肥大細胞白血病、急性髓系白血病中進行了相關研究，這些IRE1α特異性抑制劑通過抑制增殖、觸發凋亡，以劑量和時間依賴性抑制細胞生長，并且與原有的抗癌藥物具有協同效應。

抑制IRE1α也可提高抗腫瘤免疫。在從卵巢癌患者標本中分離的T細胞中，XBP1的上調與T細胞向腫瘤浸潤減少和IFNG mRNA表達降低有關。患有卵巢癌且T細胞XBP1選擇性缺失的小鼠抗腫瘤免疫能力更強，并且延緩了癌癥的惡性進展，提高了總生存率。故控制ERS或靶向IRE1α-XBP1信號通路可能有助于恢復腫瘤宿主T細胞的代謝適應性和抗腫瘤能力[11]。這些數據表明靶向阻斷IRE1α-XBP1信號通路可能是一種潛在的抗癌治療策略。

1.3 靶向PERK-eIF2α-ATF4通路PERK蛋白在肝癌組織中高表達且與腫瘤的侵襲能力和索拉菲尼抵抗密切相關[12]。PERK-真核細胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α，eIF2α)-活性轉錄因子4(activating transcription factor4，ATF4)信號通路是導致癌癥生長和耐藥的原因。PERK缺乏的細胞對ERS敏感，抑制PERK可以抑制缺氧耐藥癌細胞。PERK對放療的療效也有顯著影響，溶酶體相關膜蛋白3 (lysosomal associated membrane protein 3，LAMP3)是UPR的PERK-ATF4軸誘導的，LAMP3在乳腺癌放療患者中有預后價值。敲除PERK-ATF4-LAMP3軸或化學抑制PERK可以使MDA-MB-231乳腺癌細胞對放療敏感，下調LAMP3還會使耐藥乳腺癌細胞對它莫西芬重新敏感[13]。

PERK、eIF2α的小分子抑制劑也可能具有潛在的抗腫瘤作用。PGSK2656157是一種ATP競爭性的PERK酶活性抑制劑，可以通過改變氨基酸代謝，降低血管密度和血管灌注，抑制小鼠體內多種人腫瘤異種移植瘤的生長。GSK2606414是一種口服有效的選擇性PERK抑制劑，可以抑制細胞中PERK的激活，并抑制小鼠體內的人類腫瘤異種移植瘤的生長，用其處理乳腺癌細胞提高了癌細胞對放療的敏感性[14]。ISRIB是一種PERK-eIF2α活性抑制劑，Nguyen等[15]利用小鼠和人前列腺癌模型，發現在晚期前列腺癌中PERK-eIF2α被選擇性激活，推動了腫瘤的侵襲性進展，ISRIB通過靶向蛋白的合成，可選擇性地觸發對侵襲性轉移性前列腺癌的細胞毒性，利用ISRIB靶向eIF2α信號通路可以限制腫瘤細胞的轉移和侵襲。

抑制內質網應激PERK通路，可以提高抗腫瘤免疫。骨髓來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是多種疾病相關病理的中心驅動因素，這些細胞的主要功能特征是抑制免疫反應以抑制炎癥。在MDSCs中，抑制PERK表達可誘導抗腫瘤T細胞，并與免疫治療具有協同作用[16]。通過以上研究結果可知，抑制PERK相關信號通路可能是癌癥治療的一個靶點，研究其相關機制可能為腫瘤治療提供新方向。

1.4 靶向ATF6通路ATF6在UPR中發揮細胞保護作用，這是細胞在ERS下生存所必需的。ATF6α的激活促進了癌細胞的存活。有研究發現ATF6α在宮頸癌細胞中表達較高，抑制ATF6可以降低細胞活力和遷移，通過抑制Bcl-2和增加caspase-3促進細胞凋亡[17]。ATF6還與腫瘤耐藥相關，在1104例高級別漿液性卵巢癌組織中，DNA結合抑制因子1(ID1)和ATF6的表達存在顯著相關性，高表達ID1或ATF6的患者對鉑類治療耐藥，整體生存率和無進展生存率較差[18]。Gallagher等[19]研究鑒定了ATF6信號的選擇性抑制劑，即小分子Ceapins，這是一類吡唑酰胺，它可以阻斷ATF6α信號通路來響應ERS。Ceapins使細胞對ERS敏感，而不影響非應激細胞的活力，高度特異性抑制ATF6α信號，而且不抑制高爾基蛋白酶或其他UPR分支，因此有潛力用于開發以誘導癌細胞死亡。Bu等[20]研究指出,褪黑素或siRNA抑制了ATF-6表達顯著增加C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)表達水平，進而抑制環氧合酶-2的表達，增強ERS條件下肝癌細胞凋亡。故靶向阻斷ATF6α信號通路可能是一種潛在的抗腫瘤治療策略。

1.5 靶向ERS相關自噬腫瘤細胞發生ERS不僅可誘導UPR，還可誘導自噬。自噬作為一種減輕ERS并允許細胞存活的方式促進了腫瘤的生長。在肝癌細胞中，ERS增強了肝癌細胞的自噬通量，有助于維持細胞活力[21]。ERS依賴性自噬還可增強肝癌細胞耐藥，研究發現鋅指蛋白263在肝細胞癌患者和細胞系中表達上調并且通過激活ERS相關的自噬增加了肝癌細胞的化療耐藥性[22]。在黑色素瘤細胞中，BRAFi誘導的細胞自噬可以促進癌細胞在ERS條件下的增殖和轉移；在宮頸癌細胞中，TAW誘導的自噬能對抗細胞的凋亡。靶向ERS相關自噬具有潛在的抗腫瘤作用，如黃芪多糖可通過下調PI3K/AKT信號通路的自噬而在肺癌中發揮抗腫瘤作用[23]。褪黑激素通過下調細胞自噬增強了索拉非尼對人肝癌細胞系的抗腫瘤作用[24]。在三陰性乳腺癌中，紫杉醇耐藥MDA-MB-231乳腺癌細胞系自噬活性增強，抑制自噬增強了耐藥細胞的死亡。用自噬抑制劑氯喹處理宮頸癌HeLa細胞后促進了紫杉醇誘導的細胞凋亡。Zhou等[25]研究發現,低濃度的褪黑激素通過PERK-ATF4-Beclin1通路抑制自噬，增加了肝癌患者對索拉非尼的敏感性，其研究表明在肝細胞癌患者標本中，自噬相關蛋白Beclin1的表達與PERK的表達高度相關，聯合表達PERK和Beclin1的患者病情更嚴重，總生存時間更短。通過特定抑制劑抑制ERS和自噬時，索拉非尼誘導細胞凋亡增加，選擇性敲除PERK和ATF4表達降低了索拉非尼誘導的自噬活性，且沉默ATF4抑制了Beclin1的表達。

2 增強ERS介導的促死亡通路

持續強烈的ERS通過CHOP、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和caspase-12 3條信號通路介導促死亡通路是治療腫瘤的另一策略。其中，CHOP和JNK信號通路是ERS和細胞凋亡之間相互聯系的重要分子，caspase-12是caspase家族中唯一一個僅在ERS途徑中被激活，而不參與線粒體凋亡途徑和死亡受體途徑的分子，是細胞凋亡命令的執行者。CHOP通過干擾細胞周期、損傷相關基因、抑制內質網蛋白折疊能力，而在細胞凋亡中具有重要功能。在肺癌及肝癌的小鼠模型中，觀察到CHOP的特異性缺失會導致腫瘤的生長，促進腫瘤的發展，故上調CHOP表達可能是一個潛在的抗癌治療靶點。白藜蘆醇通過提高胞質Ca2+水平，激活PERK、eIF2α和上調CHOP，選擇性地誘導吉非替尼耐藥的非小細胞肺癌細胞死亡。褪黑激素通過下調PI3K/AKT通路、增加CHOP水平來減弱ERS誘導的人肝癌細胞對阿霉素的耐藥性[26]。ERS相關途徑通過JNK信號通路在腫瘤治療中發揮重要作用。激活的IRE1α與腫瘤壞死因子受體相關因子2 (TRAF2)相互作用，導致凋亡信號調節激酶1 (ASK1)和JNK的增加，進而誘導細胞凋亡。敲除小鼠的JNK基因后導致腫瘤數量增加并且加快了腫瘤的生長速度，表明JNK通路可能通過抑制腫瘤細胞的生成或誘導腫瘤細胞凋亡，防止腫瘤的發生。IRE1α-JNK-JUN通路可恢復KRAS突變的結腸癌細胞系對MEK抑制劑的敏感性。

另外有幾種ERS誘導劑有潛力用作抗癌藥物治療。Eeyarestatin I (EerI)是一種內質網應激相關降解途徑(ER-associated degradation,ERAD)抑制劑，該抑制劑阻斷未折疊蛋白從內質網進入細胞質降解，它與硼替佐米有類似的抗腫瘤和生物活性，并可與硼替佐米協同作用，通過誘導ERS，對癌細胞產生細胞毒性。用EerI處理人黑色素瘤細胞時，GRP78在胞質中積累，CHOP在細胞核中積累，與單藥治療相比，EerI和順鉑聯合治療導致黑色素瘤細胞死亡顯著增加。衣霉素(TM)是一種天然產生的抗生素，它通過阻斷內質網和高爾基體中n-鏈寡糖生物合成的第一步來抑制蛋白質糖基化。衣霉素在各種癌癥中表現出明顯的抗腫瘤活性，其通過UPR誘導ERS，從而促進細胞凋亡。TM誘導的ERS增加了乳腺癌細胞對放療的敏感性，通過調控Akt/NF-kB信號通路抑制乳腺癌細胞生長和轉移，并且抑制MCF7乳腺癌干細胞的侵襲性[27]。TM誘導的ERS，可以通過抑制N-糖基化抑制頭頸部癌細胞的發生；通過激活mTORC1促進前列腺癌細胞凋亡；通過誘導E-cadherin介導的細胞粘附，使未分化結腸癌細胞的增殖受到抑制。TM還可以增強癌癥細胞對藥物的敏感性，如增強順鉑對肺癌生長的抑制作用，增強人非小細胞肺癌細胞對厄洛替尼的敏感性等。Brefeldin A 是一種細胞內蛋白質轉運抑制劑，可阻斷蛋白質向高爾基體的運輸使蛋白質在內質網中積累，誘導ERS。研究表明Brefeldin A能有效誘導結腸癌、乳腺癌細胞凋亡，還能降低MMP-9活性，提示其在結腸癌、乳腺癌發生和轉移階段可有效抑制其進展[28]。毒胡蘿卜素(TG)是ERS源，啟動UPR介導的凋亡，對多種腫瘤細胞系具有潛在的抗癌活性。最近Linder等[29]證明，TG處理的人前列腺癌和結腸癌細胞株，通過死亡受體5、MAP1LC3B的非自噬功能以及UPR等途徑誘導細胞死亡。另外在食管鱗癌、黑色素瘤及腎上腺皮質癌中，也觀察到TG通過激活ERS誘導癌細胞凋亡，提高了抗癌藥物治療療效。蛋白酶體抑制劑也可能通過不同途徑加重內質網負荷，引起內質網應激介導的細胞死亡。有研究報道，硼替佐米可能通過ERS導致的活性氧(ROS)增加使細胞產生凋亡從而抑制多發性骨髓瘤[30]。因此，通過誘導持續的ERS介導的促死亡通路為ERS相關的抗腫瘤治療提供了另一途徑。

3 結論與展望

UPR是細胞應對ERS的一種重要的保護機制。正常細胞所處的內環境適宜細胞生長，不需要利用UPR，而腫瘤細胞處在腫瘤微環境中需要依賴于UPR信號以在不利環境中生存，因此，靶向UPR相關信號通路可能有利于特異性地消除癌細胞。同時，過度激活ERS超過癌細胞所能承受的閾值，以激活細胞的促凋亡通路也可導致細胞死亡。然而我們需要思考的是，UPR既具有促生存效應，也可以激活下游的促凋亡通路，單純抑制UPR信號通路可能會抑制其激活的促凋亡通路，這樣反而促進了癌細胞的存活。因此，我們希望找一種方法，既可以抑制UPR的促生存效應，又對下游的促凋亡通路不產生影響，使癌細胞走向凋亡。另外，不斷增強ERS的強度對正常細胞也可能產生影響，故我們希望找到一個臨界值，既促進癌細胞凋亡，又對正常細胞不產生影響，以更好地促進癌癥的治療。盡管近年來國內外關于ERS方面的研究已經取得了一些成果，但并不完善，仍然存在許多問題。因此，研究者仍需不斷地闡明ERS在腫瘤治療中的作用機制，以便為腫瘤治療提供新的思路。