CysLT1R對APP-HEK293細胞Aβ生成的調控作用及其機制

龍 燕，柯 璇，洪 浩

(中國藥科大學藥學院藥理系，江蘇 南京 211198)

淀粉樣蛋白-β(Aβ)是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的主要病理標志，Aβ誘導的神經毒性和神經纖維纏結被認為是引起和延續AD神經退行性過程的關鍵事件。Aβ級聯假說認為Aβ在腦內異常升高、聚集、交聯、沉積形成老年斑(senile plaque，SP)，造成神經元變性、壞死、突觸可塑性下降和記憶障礙。Aβ主要有Aβ1-42和Aβ1-40兩種，其中Aβ1-42的疏水性更強，更易形成寡聚體，形成SP沉淀的核心。Aβ通過β分泌酶和γ分泌酶先后剪切β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid β-protein precursor，APP)而產生[1]。正常情況下，Aβ的產生和清除保持平衡，但是當APP基因突變、APP裂解酶或Aβ降解酶中任一者功能異常時，Aβ產生和清除間的平衡就被打破，Aβ異常升高導致級聯病理損傷，形成AD[2]。

半胱氨酰白三烯受體1(cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLT1R)是一種G蛋白偶聯受體，由6個親水環連接著7個跨膜疏水區組成[3]。CysLT1R在外周的氣道平滑肌細胞和上皮細胞、血管內皮細胞以及嗜酸性粒細胞等均有表達，在中樞的神經元和膠質細胞也有表達[4]。有研究資料顯示，生理狀態下大腦CysLT1R表達水平明顯低于病理狀態下的水平[5]，這提示CysLT1R表達上調很可能是組織器官病理反應的信號。近年來，人們研究發現基因敲除CysLT1R和藥物阻斷(普魯司特和孟魯司特)CysLT1R可通過抑制小膠質細胞激活、神經炎癥和神經毒性，減輕LPS和鏈脲佐菌素誘導的AD樣損傷[6-8]；向小鼠腦海馬注射CysLT1R 激動劑半胱氨酰白三烯D4(leukotriene D4，LTD4)可以降低小鼠學習記憶能力[9]；而CysLT1R拮抗劑普侖司特可以顯著改善Aβ誘導的AD模型小鼠認知功能障礙[10]。本課題組近期研究結果顯示，AD患者海馬和前額葉皮層中CysLT1R蛋白和mRNA水平明顯增加[11]。以上研究均表明CysLT1R在AD的發病過程中起重要作用，但目前其作用機制仍不清楚。本研究的目的是探究CysLT1R對APP-HEK293細胞中Aβ生成的影響并探尋其可能的作用機制，為進一步闡明CysLT1R在AD發病過程中的重要作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 穩定表達APP的人胚胎腎293細胞(APP-HEK293)由中國藥科大學徐曉軍副教授課題組惠贈。

1.1.2試劑 YM17690(108806-41-3，上海康曼生物科技有限公司)，普侖司特(150821-03-7，美國Sigma-Aldrich公司)，LV-CysLT1R-EGFP(00015399，上海吉凱基因化學技術有限公司)，DMEM培養基(12100046，美國Hyclone公司)，人Aβ1-40酶聯免疫試劑盒、人Aβ1-42酶聯免疫試劑盒(CSB-E06928Eq、CSB-E10684h，武漢華美生物工程有限公司)，兔抗APP 抗體、兔抗BACE1抗體、兔抗NF-κB p65抗體(2452S、5606S、4764T，美國CST公司)，兔抗PS1抗體、兔抗PS2抗體、鼠抗CysLT1R抗體(sc-7860、sc-1456-R、sc-514181，美國Santa cruz公司)，兔抗β-actin抗體、山羊抗兔二抗IgG(BM3873、BA1039，中國博士德生物工程有限公司)，Alexa Fluor 488 標記驢抗兔 IgG、Alexa Fluor 594標記山羊抗小鼠IgG(34206ES60、33212ES60，上海翊圣生物科技有限公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、DAPI(P0012、C1002，碧云天生物技術有限公司)，膜蛋白、核蛋白和胞質蛋白抽提試劑盒(C510002，上海生工生物工程股份有限公司)，Clathrin siRNA、β-arrestin-2 siRNA、Rab-5 siRNA(蘇州吉瑪基因股份有限公司)，Lipofactamine 2000(11668-019，美國Invitrogen公司)，Protein A agarose瓊脂糖珠(16-156，美國Sigma-Aldrich公司)。

1.1.3儀器 RT-6000型酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)，轉移電泳槽和轉移電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Tanon4200 型化學發光成像分析系統、Tanon3500 型數碼凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司)，Eppendorf Master Cycler PCR儀(德國Eppendorf)，DMI3000 B熒光顯微鏡(德國 LEICA)。

1.2 方法

1.2.1試劑的配置 含普侖司特的培養基配制：稱取普侖司特0.490 5 g，溶解到1 mL PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)中，得到終濃度為1.0 mol·L-1的母液。臨用取1.0 μL母液，用培養基稀釋至1 000 mL。含YM17690的培養基配制：稱取YM17690 0.491 5 g，溶解到1 mL PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)中，得到終濃度為1.0 mol·L-1的母液。臨用取1.0 μL母液，用培養基稀釋至1 000 mL。

1.2.2APP-HEK293細胞的病毒轉染 APP-HEK293細胞接種于細胞瓶中。用促轉染溶液(enhanced infection solution，Eni.S)將慢病毒稀釋成病毒滴度為1×1010TU·L-1的病毒稀釋液。細胞瓶中加入病毒稀釋液和Polybrene(50 mg·L-1)稀釋液，轉染5 d(120 h)后，檢查病毒轉染效率。

1.2.3ELISA法檢測細胞培養基中Aβ的含量 給予CysLT1R激動劑YM17690(1 μmol·L-1)及拮抗劑普侖司特(1 μmol·L-1)12 h后，收集各組細胞的培養基上清液，按照試劑盒說明書規定的方法測定細胞培養基中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。

1.2.4Western blot法檢測APP、BACE1、PS1、PS2蛋白表達水平和CysLT1R和NF-κB p65的細胞分布 藥物干預后用細胞刮收集細胞，按照試劑盒說明書步驟分步提取細胞的膜蛋白、核蛋白和胞質蛋白。用BCA法檢測蛋白含量，上樣、電泳、轉膜，加入一抗APP(1 ∶1 000)、BACE1(1 ∶1 000)、PS1(1 ∶1 000)、PS2(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶3 000)、CysLT1R(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶3 000)、Histone 3(1 ∶3 000)和Na+-K+-ATPase(1 ∶3 000)，4 ℃過夜，洗去一抗，加入適當的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，洗去二抗，隨后采用化學發光成像系統成像，蛋白條帶積分光密度值用Gel-Pro掃描分析。其中以β-actin為胞質蛋白內參、Histone 3為核蛋白內參、Na+-K+-ATPase為膜蛋白內參。

1.2.5細胞免疫熒光法檢測CysLT1R和NF-κB p65的細胞分布 細胞接種于24孔板中，培養過夜。給予CysLT1R激動劑YM17690(1 μmol·L-1)及拮抗劑普侖司特(1 μmol·L-1)2 h后，固定封閉處理細胞，孵育抗體CysLT1R(1 ∶200)、NF-κB p65(1 ∶200)，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次。加入適當的熒光二抗(1 ∶500)，室溫避光孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次，加入少量DAPI染核5 min，PBS沖洗5 min×3次，加入防淬滅甘油，Leica DMI3000熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6siRNA轉染 將細胞接種于6孔板中。取clathrin siRNA、β-arrestin-2 siRNA、Rab-5 siRNA按說明書制成siRNA-Lipofactamine 2000復合物。6孔板加入siRNA-Lipofactamine 2000復合物后，細胞無血清培養基培養6 h后更換為完全培養基，12 h后細胞分組并開展后續藥物干預實驗。

1.2.7免疫共沉淀法分析CysLT1R和NF-κB p65的蛋白相互作用 單獨給予CysLT1R激動劑YM17690(1 μmol·L-1)或同時給予拮抗劑普侖司特(1 μmol·L-1)2 h后，RIPA裂解液裂解細胞，離心后收集上清液，加入Protein A瓊脂糖珠，離心，收集上清，棄去Protein A瓊脂糖珠。BCA法測定蛋白含量，稀釋蛋白至1 g·L-1，以每1 mL總蛋白中加入1 μg抗體的比例(1 ∶1 000)加入NF-κB p65抗體，4 ℃過夜，等量Normal Rabbit IgG作為陰性對照。加入Protein A瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜。洗滌、離心，重復6次。上樣緩沖液重懸瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，99 ℃變性10 min，電泳，轉膜，加入一抗CysLT1R(1 ∶1 000)4 ℃過夜。洗去一抗，加入適當的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，洗去二抗，隨后采用化學發光成像系統成像。

2 結果

2.1 激活CysLT1R增加APP-HEK293細胞中Aβ的生成轉染LV-CysLT1R-EGFP 5 d后，Western Blot驗證病毒轉染效率，結果顯示：與陰性對照組相比，感染LV-CysLT1R-EGFP的APP-HEK293細胞中CysLT1R表達水平明顯增加(Fig 1)。ELISA檢測結果顯示，CysLT1R激動劑YM17690升高APP-HEK293細胞中Aβ1-40和Aβ1-42的分泌水平，而預先給予CysLT1R拮抗劑普侖司特能抑制Aβ1-40和Aβ1-42的分泌(Fig 2A、B)。

Fig 1 LV-CysLT1R-EGFP transfection significantly Western blot detection of the expression of CysLT1R in APP-HEK293 cells after LV-CysLT1R-EGFP transfection.*P<0.01 vs LV-EGFP group.

為了進一步探究CysLT1R影響Aβ生成的具體環節，給予CysLT1R激動劑YM17690(1 μmol·L-1)及拮抗劑普侖司特(1 μmol·L-1)12 h后，我們采用Western blot檢測APP-HEK293細胞中APP、β分泌酶BACE1、γ分泌酶亞基PS1、PS2的表達，結果顯示，激活CysLT1R對APP和PS1、PS2的表達沒有影響，但能上調BACE1的表達，并且預先給予普侖司特能抑制BACE1的上調(APP:P>0.05;BACE1:P<0.05;PS1:P>0.05;PS2:P>0.05;n=4,Fig 3A-F)。

Fig 2 Activation of CysLT1R increased Aβ 1:LV-EGFP+Veh+Veh;2:LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh;3:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Veh;4:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Pran.A:Levels of Aβ1-40 in cell culture medium;B:Levels of Aβ1-42 in cell culture medium.*P<0.05 vs LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh group.

2.2 激活CysLT1R引起受體和NF-κB p65亞基的核轉位GPCR在激活后往往發生內化從而下調細胞表面受體的水平，因此，我們觀察CysLT1R激活后細胞內受體的分布情況。Western blot結果顯示，激活CysLT1R使細胞膜及細胞質中受體水平明顯下降，而細胞核中受體水平升高，并且預先給予普侖司特能抑制受體分布的這種變化(Fig 4A-C)。免疫熒光實驗也證實了這一結果(Fig 5)。已有研究表明，CysLT1R的激活與NF-κB信號通路有關[10]，為此我們研究了NF-κB p65亞基的細胞分布情況。Western blot結果顯示，激活CysLT1R使細胞質中NF-κB p65亞基水平下降，而細胞核中其水平升高，并且預先給予普侖司特能抑制NF-κB p65亞基的分布變化(Fig 6A、B)。

2.3 抑制CysLT1R核轉位減少細胞中Aβ的生成已有文獻報道，CysLT1R的內化依賴于clathrin、β-arrestin-2和Rab-5等蛋白的輔助[12]，為了探究CysLT1R對Aβ生成的影響是否與其內化后的核轉位相關，我們首先應用siRNA分別敲減上述三個內化輔助因子。Western blot結果顯示，敲減clathrin和β-arrestin-2顯著抑制了APP-HEK293細胞中CysLT1R激活后發生的受體核轉位，而敲減Rab-5對此無明顯影響(Fig 7A-F)。免疫熒光實驗也證實了這一結果(Fig 7G、H)。檢測Aβ結果顯示，敲減clathrin和β-arrestin-2顯著抑制Aβ1-40和Aβ1-42的分泌，而敲減Rab-5對此無明顯影響(Fig 7F-H)。此外，敲減clathrin和β-arrestin-2還顯著抑制BACE1的表達，而對APP的表達沒有明顯影響(Fig 8A-C)。

Fig 3 Effect of CysLT1R activity on expression of APP,BACE1,PS1,1:LV-EGFP+Veh+Veh;2:LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh;3:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Veh;4:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Pran.A:Expression of APP and BACE1 in APP-HEK293 cells after administration of YM17690 (1 μmol·L-1)and pranlukast (1 μmol·L-1)for 12 h;B:Statistical analysis of the expression of APP;C:Statistical analysis of the expression of BACE1;D:Expression of PS1 and PS2 in APP-HEK293 cells after administration of YM17690 (1 μmol·L-1)and pranlukast (1 μmol·L-1)for 12 h;E:Statistical analysis of the expression of PS1;F:Statistical analysis of the expression of PS2.*P<0.05 vs LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh group.

Fig 4 Nuclear translocation of CysLT1R by Western 1:LV-EGFP+Veh+Veh;2:LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh;3:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Veh;4:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Pran.A:The expression of CysLT1R in nucleus.B:The expression of CysLT1R in cytoplasm.C:The expression of CysLT1R on the cell membrane.*P<0.05 vs LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh group.

2.4 抑制CysLT1R核轉位能抑制NF-κB p65亞基的核轉位CysLT1R核轉位與NF-κB信號通路的相關性研究結果顯示，敲減clathrin和β-arrestin-2能抑制NF-κB p65亞基的核轉位(Fig 9A、B)。

2.5 CysLT1R與NF-κB p65亞基在細胞核內存在相互作用為了研究CysLT1R入核的意義，我們采用免疫共沉淀法研究了CysLT1R與NF-κB p65亞基是否存在相互作用。結果顯示，單獨給予YM17690激活CysLT1R時，核蛋白提取物經anti-NF-κB p65抗體沉淀后仍能檢測到CysLT1R蛋白，表明CysLT1R與NF-κB p65亞基間存在相互作用，而預先給予普侖司特能抑制兩者之間的這種相互作用(Fig 10A)。而在其胞質蛋白提取物中暫未發現CysLT1R與NF-κB p65亞基的相互作用(Fig 10B)。

Fig 5 Nuclear translocation of CysLT1R by cell immunofluorescence 1:LV-EGFP+Veh+Veh;2:LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh;3:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Veh;4:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Pran.A:The location of CysLT1R in the nucleus;B:Statistical results of the nuclear localization of CysLT1R.*P<0.05 vs LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh group.

Fig 6 Nuclear translocation of NF-κB p65 1:LV-EGFP+Veh+Veh;2:LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh;3:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Veh;4:LV-CysLT1R-EGFP+YM17690+Pran.A:The distribution of NF-κB p65 subunit in nucleus;B:The distribution of NF-κB p65 subunit in cytoplasm.*P<0.05 vs LV-CysLT1R-EGFP+Veh+Veh group.

Fig 7 Inhibition of nuclear translocation of CysLT1R reduces Aβ production in 1:Veh+Scramble siRNA;2:YM17690+Scramble siRNA;3:YM17690+Clathrin siRNA;4:YM17690+β-arrestin-2 siRNA;5:YM17690+Rab-5 siRNA.A-C:Expression of CysLT1R in nucleus,cytoplasm and cell membrane by Western blot and the statistical results;D-E:Expression of CysLT1R in nucleus,cytoplasm and cell membrane by cell immunofluorescence staining and the statistical results;F-H:Levels of Aβ1-40 and Aβ1-42 by Western blot and the statistical results.*P<0.05 vs YM17690+Scramble siRNA group.

Fig 8 Inhibition of nuclear translocation of CysLT1R reduced BACE1 1:Veh+Scramble siRNA;2:YM17690+Scramble siRNA;3:YM17690+Clathrin siRNA;4:YM17690+β-arrestin-2 siRNA;5:YM17690+Rab-5 siRNA.A-C:Expression of BACE1 and APP by Western blot and the statistical results.*P<0.05 vs YM17690+Scramble siRNA group.

Fig 9 Knockdown of clathrin and β-arrestin-2 inhibited nuclear translocation of NF-κB p65 1:Veh+Scramble siRNA;2:YM17690+Scramble siRNA;3:YM17690+Clathrin siRNA;4:YM17690+β-arrestin-2 siRNA;5:YM17690+Rab-5 siRNA.A:The distribution of NF-κB p65 subunit in nucleus by Western blot and the statistical results.B:The distribution of NF-κB p65 subunit in cytoplasm by Western blot and the statistical results.*P<0.05 vs YM17690+Scramble siRNA group.

Fig 10 CysLT1R interacted with NF-κB p65 subunit in nucleusA:The nucleoprotein extracts were prepared and co-immunoprecipitated by NF-κB antibody with IgG as negative control.B:The cytoplasmic extracts were prepared and co-immunoprecipitated by NF-κB antibody with IgG as negative control.

3 討論

有研究表明，CysLT1R參與并調節AD的發病過程[8-11]，并且CysLT1R在腦內表達隨年齡的增長而增加，這與Aβ沉積增加和行為缺陷密切相關[13]。但目前對CysLT1R調節Aβ積累的具體作用機制的研究仍較匱乏，同時CysLT1R與NF-κB途徑之間的關系也需進一步闡明。YM17690 是一種選擇性CysLT1R激動劑，其遠遠優于LTD4的化學穩定性使它逐漸成為研究CysLT1R特性的一個重要工具藥物[9-10]。因此，本實驗采用 YM17690 作為CysLT1R特異性激動劑。

CysLT1R是一種G蛋白偶聯受體，由6個親水環連接著7個跨膜疏水區組成[4]。長久以來，GPCR都被視為是一類細胞表面受體，近年來，已發現越來越多的GPCR在細胞內其他的一些區室發揮作用，如細胞核、線粒體、內質網等。目前已發現超過40種細胞核GPCR，細胞核GPCR大部分來源于質膜轉位[14]。已經有大量的研究表明，GPCR內化的最可能機制是通過clathrin包被的小泡進行內吞[15]。2005年首次有研究報道在細胞核中觀察到了CysLT1R[16]。此后的研究表明，如同多數GPCR一樣，CysLT1R在質膜被激活后隨即經內吞作用發生內化。CysLT1R的內化由clathrin、β-arrestin-2和Rab-5共同介導[12]。基于此，我們使用siRNA在APP-HEK293細胞中分別敲減上述三種蛋白。結果顯示，敲減clathrin或β-arrestin-2可以有效抑制CysLT1R的核轉位，而敲減Rab-5對此無影響。Rab-5介導的內體融合通常標志著受體進入降解程序[12]，這提示我們本實驗中高表達CysLT1R受體的APP-HEK293細胞受體內化后的去路是核轉位，并且CysLT1R的核轉位是其參與Aβ生成調控的必要環節。

有研究表明，Aβ激活NF-κB有2種可能機制：一種是通過RAGE間接激活，一種是直接激活方式[17]。并且，Aβ1-42誘導NF-κB報告基因的轉錄，誘導NF-κB p65亞基向細胞核移位[18]。本實驗中，我們還發現激活CysLT1R可以引起NF-κB p65亞基的核轉位，CysLT1R與NF-κB p65亞基間在細胞核內相互結合。因此，我們有理由推測，激活CysLT1R引起受體內化與核轉位，從而上調BACE1表達進而誘導細胞生成Aβ1-42，后者誘導NF-κB p65亞基向細胞核轉位。而NF-κB p65亞基向細胞核移位是激活NF-κB信號通路的重要步驟，從而進一步促進Aβ生成，最終導致AD的淀粉樣變性和神經退行性變。當然，CysLT1R與NF-κB p65亞基間在細胞核內相互結合說明這兩種蛋白之間存在相互作用，這種相互作用對NF-κB信號通路產生何種影響仍需進一步探究。

綜上所述，CysLT1R的核轉位及核分布參與了NF-κB信號通路的激活，這與該受體誘導Aβ的生成有關。