TGF-β1調控Cdk5表達在人腎系膜細胞外基質沉積中的作用

周 毅，楊亞坤，康 平，柳 丹，夏順杰，張 悅，劉 巍

(河北醫科大學 1.第二醫院、2.病理學教研室、3.診斷學教研室，河北 石家莊 050017)

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)可導致漸進性、不可逆性的腎單位丟失和腎組織損傷，繼而出現腎功能障礙，并最終進展至終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease，ESRD)。腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病發生、發展的中心環節和重要特征，是其進展至ESRD的共同通路之一[1-2]。早期明確診斷并采取針對性治療，可有效延緩腎臟纖維化的發生和進展。但是，一直以來，由于纖維化的診斷缺乏早期、精準的特異性標志物，使得其治療亦缺乏針對性。因此，闡明其發病機制，對于預防及早期干預疾病的發生發展具有重要意義。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一類重要的致纖維化生長因子，其家族成員TGF-β1在腎臟細胞中有廣泛表達，可通過抑制細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解，在腎間質基質沉積中發揮重要作用。細胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)作為一種蛋白激酶，通過磷酸化相應底物發揮其生理學作用。本課題組前期研究發現，高糖、TGF-β1等因素，可導致p35斷裂為p25，繼而激活Cdk5，使其激酶活性異常升高，在糖尿病腎病足細胞損傷及凋亡的發生、發展過程中發揮重要作用[3-4]。本文在此基礎上，以人腎小球系膜細胞為研究對象，重點探討TGF-β1調控Cdk5表達在系膜細胞外基質沉積中所起的作用，以期進一步明確TGF-β1促進腎臟纖維化的作用機制，為探索腎臟纖維化的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 DMEM/F12培養基(Gibco)、胎牛血清(Gibco，No.10100147)。TGF-β1(MCE，HY-P7118)，Roscovitine(Abcam，ab141847)，0.25%胰蛋白酶(Solarbio，No.T1300)。DN-Cdk5質粒(Addgene，#1871)。兔抗Cdk5單克隆抗體(Abcam，ab40773)，兔抗p35/25多克隆抗體(CST，#2680)，兔多克隆Collagen Ⅳ抗體(Proteintech，No.55131-1AP)、鼠單克隆FN抗體(Proteintech，No.66042-1-Ig)，FITC標記羊抗鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，115-095-003)，Cy3標記羊抗兔IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，111-165-003)。PCR引物(上海生工)，Real time-PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology，RR820A)。

1.1.2細胞 人腎小球系膜細胞(HMC)為本實驗室凍存細胞，復蘇、傳代后備用。

1.1.3儀器設備 CO2培養箱(美國Thermo Scientific)，恒溫孵育箱(天津泰斯特)，超低溫冰箱(青島海爾)，高速低溫離心機(德國Eppendorf)，電泳槽、電泳儀(美國Bio-Rad)，光學顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus)，熒光實時定量PCR儀(美國Agilent)，Odyssey FC成像儀(美國Li-COR Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1細胞分組

1.2.1.1 TGF-β1對Cdk5蛋白及mRNA表達的影響 HMC接種于6孔板，10 μg·L-1的TGF-β1分別刺激0、3、6、12、24 h，Western blot、免疫熒光化學法檢測Cdk5、p35/25蛋白表達情況，Real time-PCR檢測Cdk5 mRNA表達。

1.2.1.2 Cdk5對系膜細胞FN、Collagen Ⅳ表達的影響 轉染Cdk5過表達質粒，并設置空白對照組和質粒對照組，Western blot、免疫熒光化學法檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達情況。

1.2.1.3 Cdk5抑制劑Roscovitine對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達的影響 細胞隨機分為Control組、TGF-β1刺激組(10 μg·L-1的TGF-β1刺激24 h)，TGF-β1+Roscovitine組(10 μg·L-1的TGF-β1和10 μmol·L-1Roscovitine混合培養基刺激24 h)，Western blot、免疫熒光化學法檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達情況，Real time-PCR檢測FN、Collagen Ⅳ mRNA的表達。

1.2.1.4 Cdk5干擾質粒對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達的影響 細胞隨機分為Control組、TGF-β1+質粒對照Vector組，TGF-β1+DN-Cdk5組。TGF-β1+Vector組和TGF-β1+DN-Cdk5組，分別轉染相應質粒24 h后，再給予TGF-β1(10 μg·L-1)刺激24 h，Western blot、免疫熒光化學法檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達情況，Real time-PCR檢測FN、Collagen Ⅳ mRNA的表達。

1.2.2質粒構建與細胞轉染 Cdk5過表達質粒和干擾質粒購自Addgene公司。1×108·L-1密度的HMC接種于6孔板，待其生長至約80%密度時，準備轉染。將3 μL FuGENE HD、1 μg質粒溶于100 μL不含血清與抗生素的培養基中，混勻，室溫靜置15 min，加入6孔板中，輕搖，培養6-8 h后改為普通培養基培養。

1.2.3Western blot檢測相關蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白，BCA法定量。取50 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，分別加入Cdk5(1 ∶500)、p35/25(1 ∶1 000)、FN(1 ∶1 000)、Collagen Ⅳ(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的IgG(1 ∶5 000)，37 ℃孵育2 h。TTBS洗膜，滴加ECL發光劑，于Odyssey FC成像系統中顯影，并對條帶進行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.2.4Real time-PCR檢測相關mRNA表達 TRIzol法提取細胞總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，NanoDrop 1000微量核酸蛋白檢測儀測定RNA純度。按照PrimeScriptTMRT regent Kit說明書進行反轉錄。取2 μL cDNA產物作為PCR反應模板，熒光實時定量PCR儀檢測相關mRNA的表達。Cdk5引物：上游5′-CTTAGGTGACGGCCCATAGT-3′，下游5′-GTAACCTGCCACTTCCACCT-3′；FN引物：上游5′-GAGCTATTCCCTGCACCTGATG-3′，下游5′-CGTGCAAGGCAACCACACT-3′；Col Ⅳ引物：上游5′-GATGGCCAGAAAGGACCAGT-3′，下游5′-GGGATTCGGGGACAGTCATC-3′；18S引物：上游5′-CATTCGAACGTCTGCCCTATC-3′，下游5′-CCTGCTGCCTTCCTTGGA-3′。擴增條件：95 ℃變性15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 1 min，45個循環，以18S作內參基因，用△△Ct法分析基因的相對表達。

1.2.5免疫細胞熒光法檢測相關蛋白的表達 從處理好的細胞培養板底部取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定；0.3%的Triton X-100打孔；血清封閉，37 ℃孵育；加入相應抗體Cdk5(1 ∶50)、p35/25(1 ∶100)、FN(1 ∶100)、Collagen Ⅳ(1 ∶100)，4 ℃過夜。滴加帶FITC或Cy3標記的二抗(1 ∶50或1 ∶100稀釋)，37 ℃避光孵育；用含DAPI的防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察相應蛋白的表達情況并照片。

2 結果

2.1TGF-β1對系膜細胞Cdk5、p35/p25表達的影響 TGF-β1(10 μg·L-1)作用于腎小球系膜細胞0、3、6、12、24 h后，隨著刺激時間的延長，Western blot檢測Cdk5蛋白表達呈時間依賴性增加。p35/p25是Cdk5的特異性協同激動劑，TGF-β1作用后，其蛋白表達與Cdk5一致，也呈時間依賴性增加(Fig 1A)。Real time-PCR法檢測TGF-β1作用于系膜細胞0、12、24 h后，Cdk5 mRNA表達的變化。與0 h相比，TGF-β1作用12 h、24 h后，Cdk5 mRNA均明顯增加(P<0.01，Fig 1B)，作用24 h時，Cdk5 mRNA增加約6.82倍。

Fig 1 Effect of TGF-β1 on expression of Cdk5 and p35/p25 in human mesangial cells n=6)A:Western blot;B:Real time-PCR；*P<0.05,**P<0.01 vs 0 h group;TGF-β1:10 μg·L-1

2.2 Cdk5對系膜細胞FN、Collagen Ⅳ表達的影響與空白對照組和空白質粒轉染組相比，轉染Cdk5過表達質粒后，Western blot檢測FN、Collagen Ⅳ蛋白表達均明顯增高(P<0.01，Fig 2A、B)；免疫熒光結果也顯示，轉染Cdk5質粒后，FN(綠色熒光)、Collagen Ⅳ(紅色熒光)蛋白表達明顯增強(P<0.01，Fig 2C)。

Fig 2 Effect of Cdk5 on expression of FN and collagen Ⅳ in human mesangial cells n=6)A-B:Western blot;C:Immunofluorescence staining；**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Vector group

2.3 Cdk5激酶活性抑制劑Roscovitine對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達的影響與空白對照組相比，TGF-β1刺激后，Western blot結果顯示系膜細胞FN、Collagen Ⅳ蛋白表達均明顯增加，而應用Cdk5激酶活性抑制劑Roscovitine后，FN、Collagen Ⅳ表達明顯降低(P<0.05，Fig 3A、B)；Real time-PCR結果顯示，TGF-β1刺激后，FN、Collagen Ⅳ mRNA表達明顯增加，應用Roscovitine后，mRNA表達降低(P<0.05，Fig 3C、D)；免疫熒光結果顯示，與對照組相比，TGF-β1刺激后，FN(綠色熒光)、Collagen Ⅳ(紅色熒光)表達明顯增多，應用Roscovitine干預后，FN、Collagen Ⅳ表達減少(Fig 3E、F)。

Fig 3 Effect of Roscovitine on expression of FN and collagen Ⅳ in HMC stimulated by TGF-β1 n=6)1.Control;2.TGF-β1;3.TGF-β1+Roscovitine.A-B:Western blot;C-D:Real time-PCR;E-F:Immunofluorescence staining；*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TGF-β1 group;TGF-β1:10 μg·L-1;Roscovitine:10 μmol·L-1

2.4 Cdk5干擾質粒對TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表達的影響與對照組相比，TGF-β1加空白質粒轉染組，Western blot結果檢測系膜細胞FN、Collagen Ⅳ蛋白表達均明顯增加，而轉染Cdk5干擾質粒后，FN、Collagen Ⅳ表達明顯降低(P<0.05，Fig 4A-C)；Real time-PCR結果可見，TGF-β1加空白質粒轉染后，FN、Collagen Ⅳ mRNA表達明顯增加，轉染Cdk5干擾質粒后，mRNA表達降低(P<0.05，Fig 4D、E)；免疫熒光結果顯示，與對照組相比，TGF-β1加空白質粒轉染組，FN(綠色熒光)、Collagen Ⅳ(紅色熒光)表達明顯增多，轉染Cdk5干擾質粒后，FN、Collagen Ⅳ表達減少(Fig 4F、G)。

Fig 4 Effect of Cdk5 knockdown plasmid on expression of FN and collagen Ⅳ in HMC stimulated by TGF-β1 n=6)1.Control;2.TGF-β1+vector;3.TGF-β1+DN-Cdk5.A-C:Western blot;D-E:Real time-PCR;F-G:Immunofluorescence staining；*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Vector group;TGF-β1:10 μg·L-1

3 討論

在我國，慢性腎臟疾病的發病率約為10.8%，正日益成為危害人民身體健康的公共衛生問題之一。腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病的共同病理學特征，主要表現為ECM的大量堆積和腎小管萎縮，并最終導致ESRD。大量研究表明，TGF-β上調與糖尿病腎病、膜性腎病和其他多種慢性腎臟疾病的發生、進展均關系密切，被認為是致腎臟纖維化的關鍵介質之一，但其具體機制目前尚未完全闡明[5]。

Cdk5是脯氨酸限定性的絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，主要通過磷酸化相應底物發揮其生理學作用。一直以來，關于Cdk5生物學功能的研究多集中于神經系統，認為其在維持神經元正常功能和神經系統發育過程中起了關鍵作用[6-7]。近年來，考慮到Cdk5及其激活亞基p35在許多神經系統外組織，如胰腺、腎臟、卵巢等部位也有廣泛表達，其神經系統外作用逐漸引起關注[8]。有研究報道，在抗腎小球基底膜腎炎模型鼠和HIV轉基因鼠腎組織中，Cdk5在增殖和去分化足細胞中的表達明顯降低；抑制Cdk5的表達可明顯改變體外培養的已分化足細胞的形態，出現胞體延長，足突消失；抑制足細胞中p35的表達可顯著增加UV輻射、嘌呤霉素氨基核苷等引起的足細胞凋亡，提示腎臟疾病中足細胞的損傷可能與Cdk5/p35的表達異常有關[9-11]。本課題組前期針對糖尿病腎病足細胞的研究也發現，高糖、TGF-β1等因素，可導致p35斷裂為p25，繼而激活Cdk5，使其激酶活性異常升高，在足細胞損傷及凋亡的發生、發展過程中發揮重要作用[3-4]。

本研究在此基礎上，以人腎小球系膜細胞為研究對象，重點探討TGF-β1調控Cdk5表達在系膜細胞外基質沉積中所起的作用。我們的研究發現，10 μg·L-1的TGF-β1刺激后，隨著時間的延長，系膜細胞Cdk5蛋白及mRNA表達呈時間依賴性增加；作為Cdk5的特異性協同激動劑，p35、p25也呈現出與Cdk5一致的表達趨勢，可見TGF-β1作用于系膜細胞后，Cdk5被激活。

膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，為了觀察Cdk5在腎臟纖維化中所起的作用，我們在系膜細胞中轉染了Cdk5過表達質粒，觀察其對FN、Collagen Ⅳ表達的影響。研究發現，與空白對照組和空白質粒轉染組相比，轉染Cdk5過表達質粒后，FN、Collagen Ⅳ蛋白表達均明顯增高，可見Cdk5在膠原蛋白合成、細胞外基質沉積中起了促進作用。進一步，我們應用Cdk5激酶活性抑制劑Roscovitine或轉染Cdk5干擾質粒，目的是降低Cdk5表達，來觀察其在TGF-β1促進細胞外基質合成中所起的作用。結果顯示，與對照組相比，TGF-β1刺激后，系膜細胞FN、Collagen Ⅳ蛋白及mRNA表達均明顯增加；而無論是應用Roscovitine還是轉染Cdk5干擾質粒后，FN、Collagen Ⅳ蛋白及mRNA表達均明顯降低，可見Cdk5在TGF-β1促進系膜細胞外基質合成的過程中發揮了重要作用。

關于TGF-β1引起腎臟纖維化的機制，目前較多的研究集中在兩個方面：即Smad信號通路和非Smad信號通路[12]。在Smad依賴的信號轉導通路中，研究報道，TGF-β1可以通過結合TGF-β受體I(TGF-β receptor I，TβRI)表面的絲/蘇氨酸激酶受體發揮其細胞效應，導致錨定蛋白SARA與Smad2/3結合并促進其磷酸化；隨后，Smad2/3磷酸化復合物與Smad4形成一高階復合物并在細胞核內積聚；在細胞核中，活性的Smad2/3/4復合物可以調節a-SMA、膠原IA2、PAI-1和MMP-2等的轉錄，繼而促進上皮-間充質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，導致ECM成分的合成和沉積[13-14]。此外，也有越來越多的證據表明，TGF-β1可以通過Smad信號通路調控多種microRNAs(miRs)，進而促進腎纖維化的進程[15]。而TGF-β1的非Smad通路，可刺激平行的下游信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途徑，細胞外信號調節激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)1/2、JNK和p38，以及生長和存活激酶，磷酸肌醇-3-激酶(phopshatidylinositol-3-kinase，PI3K)、Akt和小GTP結合蛋白(Ras、RhoA、Rac1和Cdc42)，Notch和Wnt/β-catenin途徑等，間接參與EMT、凋亡、分化和基質形成[16]。本課題組前期在對足細胞的研究中發現，TGF-β1可通過ERK1/2通路增強足細胞中Cdk5的表達，而Smads通路并不參TGF-β1 對Cdk5的調節過程[3]。因此，我們推測，在系膜細胞，TGF-β1可能同樣通過非Smad通路調節Cdk5的表達，發揮對細胞外基質合成的調控作用，其具體作用機制尚需進一步研究。

綜上，我們的研究發現，TGF-β1作用于人腎小球系膜細胞，可激活Cdk5，導致FN、Collagen Ⅳ表達增加。而抑制Cdk5后，可降低FN、Collagen Ⅳ的表達水平。可見，Cdk5在TGF-β1致腎小球系膜細胞細胞外基質沉積中發揮了重要作用。抑制Cdk5表達及激酶活性的異常增高，可能是減緩慢性腎臟病腎小球纖維化的重要手段和治療靶點。我們的研究進一步明確了TGF-β1促進腎臟纖維化的作用機制，為探索腎臟纖維化的有效防治提供理論依據。