Chidamide誘導的LncRNA ENST00000448869.1靶向作用Nestin抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長

郭亞瑞,周偉強

(沈陽醫學院基礎醫學院病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110034)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥相關死亡的重要原因。目前，乳腺癌的發病率和死亡率仍在逐年上升，其發生發展的分子機制需要深入地探索[1-2]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，由于其侵襲性和缺乏治療靶點，且雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2型(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)都是陰性，無特異性治療靶點，是乳腺癌中一類高度異質性的亞型[3-4]。

近年來，組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)在體內、外對實體瘤和血液系統惡性腫瘤顯示出良好的抗腫瘤活性[2]。西達苯胺(chidamide)是一種新型口服活性苯甲酰胺類HDACi，選擇性抑制組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)1、2、3和10的活性，HDAC 1、2、3和10是參與腫瘤細胞及其周圍微環境中腫瘤起始和發展并在其中發揮重要作用的酶。作為一種表觀遺傳調節劑，Chidamide誘導腫瘤細胞生長停滯和凋亡，并增強細胞抗腫瘤免疫[5]。

越來越多的研究表明，長非編碼核糖核酸(long non-coding RNA，LncRNA)作為一類新的重要的細胞生物學行為調控因子，在腫瘤的發生、發展和轉移中起著重要的作用[2]。LncRNA是基因組中非蛋白質編碼區的一大類轉錄物，長度超過200個核苷酸。最近的研究表明，LncRNA調節許多重要的癌癥病理過程，如腫瘤發生、增殖、轉移和耐藥性[6-8]。LncRNA主要通過與關鍵調節蛋白相互作用來調節其功能或表達[8]。本文將Chidamide作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，研究相關LncRNA在Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達情況，探討相關LncRNA在Chidamide抑制乳腺癌細胞生長中的調控機制，為進一步明確LncRNA與蛋白在乳腺癌細胞中的分子作用機制，提供相應的理論基礎和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞(ATCC細胞庫)；RPMI 1640培養基(A4192301)、胎牛血清(A3160902)、青鏈霉素(KGY0023,Thermo Scientific)；Chidamide(Chipscreen Biosciences Ltd)；Muse Count &Viability試劑盒(13-0618,Millipore)；RNA提取試劑盒(1182866500,Roche)；Power SYBR Green PCR Master mix(4367659,Life Technologies)；一抗抗體(Abcam lnc)；ECL化學發光試劑盒(B2162617,Roche)；LncRNA ENST00000448869.1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)購自廣州銳博生物技術有限公司；細胞分析儀(德國Premego)，超微量核酸檢測儀NanoDrop-2000(美國Thermo Fisher)，PCR擴增儀Mastercyler(美國Eppendorf)，實時定量PCR儀7500(美國Life Technology),電泳系統及轉膜系統(美國BIO-Rad),多通道化學發光成像系統MF-Chemi BIS2.0(以色列DNR)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人乳腺癌MDA-MB-231細胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃，5%CO2，95%濕度培養箱中培養。當細胞長至培養瓶底70%-80%時，將細胞接種至96孔板(1×107個·L-1)或6孔板(5×108個·L-1)各孔中。將已貼壁細胞更換為無血清培養基進行同步化處理后再進行下列實驗。

1.2.2高通量測序篩選陽性LncRNA 將Chidamide與MDA-MB-231細胞共同培養24 h，抽提樣品的總RNA后，利用去核糖體試劑盒將rRNA去除，并將RNA片段化(平均片段長度約為200 nt左右)，逆轉錄合成單鏈cDNA，再合成雙鏈cDNA并純化，接著末端修復并加接頭引物，PCR擴增并純化，然后再對文庫進行質檢，最后上機測序。之后聯合生物信息學軟件分析篩選陽性LncRNA分子。通過蛋白互作生物學軟件推測該LncRNA分子的互作蛋白。

1.2.3MTT和細胞活力實驗 將不同濃度的Chidamide(0、20、100 μmol·L-1)與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，經胰酶消化后收集細胞。進行MTT實驗，在490 nm的微孔板讀數器上測量吸光度；收集約2×105個(50 μL細胞懸液)細胞，每組細胞中加入450 μL Count &Viability reagent，混勻室溫靜置后應用Muse自動細胞分析儀檢測細胞活力。

1.2.4LncRNA ENST00000448869.1 siRNA(1、2、3)轉染 根據Lipofectamine 3000轉染試劑使用說明，先將無血清培養基與適量lipofectamine 3000轉染試劑混合，室溫放置5 min。再將無血清培養基分別與適量的LncRNA ENST00000448869.1 siRNA1、2、3混合，室溫放置5 min。然后將兩種混合液移到1.5 mL離心管中混勻后靜置5 min，將轉染復合物分別與六孔板中的MDA-MB-231細胞混合，培養24 h后進行后續實驗。LncRNA ENST00000448869.1 siRNA的靶序列為，siRNA1：5′-GCTCTCCTGATCA ATACAT-3′；siRNA2：5′-CCAAAGTCTCCCAGTCAAT-3′；siRNA3：5′-GGCTGGAACTTAACGCTGT-3′。

1.2.5RNA提取和Real-time PCR 將Chidamide與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，按照RNA提取試劑盒說明進行，合成第一鏈cDNA后應用SYBR Green方法進行Real-time PCR，以GAPDH為內參進行反應，檢測mRNA水平。LncRNA ENST0000044 8869.1引物序列Forward為5′-AGGCCTCGTTCAC CTTGACG-3′，Reverse為5′-CCCTTGCCACGTCCAC TACC-3′；Nestin引物序列Forward為5′-GCTGA AGCCCTGGGGAAAGT-3′，Reverse為5′-CCAGGGGAGTGGAGTCTGGA-3′。

1.2.6Western blot檢測 將Chidamide與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，收集細胞提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。取等量蛋白樣品煮沸10 min，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜上，4 ℃封閉過夜，洗膜，然后經過一抗孵育、洗膜、二抗孵育、ECL化學發光、凝膠成像系統成像。

2 結果

2.1 LncRNA ENST00000448869.1分子的表達水平在Chidamide處理后增高如Fig 1 LncRNA差異表達火山圖和熱圖分析結果顯示，用Chidamide處理乳腺癌MDA-MB-231細胞后提取RNA，通過18 s/28 s RNA比率質控后合成cDNA。應用高通量測序發現LncRNA ENST00000448869.1豐度比對照組明顯增高。在Chidamide處理乳腺癌MDA-MB-231細胞前后LncRNA ENST00000448869.1出現差異表達，Chidamide處理使ENST00000448869.1表達水平升高。結果表明，LncRNA ENST00000448869.1可能參與Chidamide作用乳腺癌細胞后細胞生長的調控。

Fig 1 The volcano map and heat map of LncRNA differential expression (MDA-MB-231Basal—MDA-MB-231CHid)The abscissa represented the change of expression multipleof LncRNA in different samples;the ordinate represented the statistical significance of the difference in gene expression,the red dot indicated that LncRNA was significantly up-regulated and the green dot indicated that LncRNA was significantly down-regulated.

Fig 2 Assay for Chidamide concentration-response effect by MTT and cell viability assay by Muse cell analyzer in MDA-MB-231 cells

2.2 LncRNA ENST00000448869.1分子與Nestin蛋白之間存在互作關系通過選取LncRNA ENST00000448869.1，可以繪制該LncRNA與其靶基因互相作用的網絡圖，從而為整體性地分析LncRNA在樣品中發揮的功能提供參考與幫助。蛋白互作生物學軟件推測LncRNA ENST00000448869.1分子與Nestin存在蛋白互作關系。因此，我們可以認為Chidamide作用乳腺癌細胞后，可能存在LncRNA ENST00000448869.1與Nestin蛋白的相互作用而影響細胞生長。

2.3 Chidamide抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞生長我們將0、20、100 μmol·L-1的Chidamide與乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，進行MTT檢測和細胞活力實驗，Fig 2結果顯示，20 μmol·L-1的Chidamide作用乳腺癌細胞，在490 nm處吸光度明顯降低，100 μmol·L-1的吸光度明顯降低，說明Chidamide作用后降低乳腺癌細胞的細胞活力；與對照組相比，低劑量(20 μmol·L-1)的Chidamide對乳腺癌細胞有抑制作用；高劑量(100 μmol·L-1)的Chidamide作用MDA-MB-231后，細胞活率為57.1%，明顯低于對照組細胞活率71.0%，抑制效果更明顯。

2.4 Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231細胞后LncRNA ENST00000448869.1和Nestin表達都增高為了驗證LncRNA的分析結果，我們應用QPCR檢測了乳腺癌MDA-MB-231細胞系中ENST00000448869.1片段的表達情況。同時為了明確Chidamide誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖中LncRNA ENST00000448869.1以及Nestin的表達水平，我們測定了0、20、100 μmol·L-1的Chidamide作用乳腺癌細胞后其LncRNA ENST00000448869.1和Nestin的mRNA表達水平，Fig 3結果顯示，乳腺癌MDA-MB-231細胞中LncRNA ENST0000044 8869.1含量在低劑量(20 μmol·L-1)和高劑量(100 μmol·L-1)Chidamide處理后都明顯上升，而Nestin的表達也在低劑量和高劑量Chidamide處理后比對照組明顯增加。該結果表明，Chidamide可以促進LncRNA ENST00000448869.1和其互作蛋白Nestin的mRNA表達水平，說明Chidamide處理乳腺癌細胞后可能存在LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之間的調控機制。具體的分子機制有待進一步探索。

Fig 3 The mRNA expression of LncRNA ENST00000448869.1 and Nestin induced by Chidamide in breast cancer cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Basal.

2.5 LncRNA ENST00000448869.1 siRNA轉染降低乳腺癌細胞中LncRNA ENST00000448869.1和Nestin的mRNA和蛋白水平針對LncRNA ENST00000448869.1分子序列設計3對特異siRNA片段用以靜默相關LncRNA的表達，LncRNA ENST00000448869.1 siRNA轉染MDA-MB-231細胞后，與Chidamide共同孵育24 h，進行細胞活力檢測；Real-time PCR測定LncRNA ENST00000448869.1的mRNA表達水平；Western blot實驗檢測Nestin的蛋白表達水平。Fig 4結果顯示：siRNA靜默LncRNA ENST00000448869.1后可明顯增強Chidamide對MDA-MB-231細胞的藥理殺傷作用，其中siRNA3作用活細胞比率為19.1%，抑制效果最明顯。Fig 5結果顯示：siRNA可明顯抑制LncRNA分子ENST00000448869.1 mRNA分子的表達；Western blot結果顯示：siRNA轉染細胞后，受Chidamide激活的Nestin的表達被明顯抑制。這些結果可以說明，siRNA有效靜默LncRNA ENST00000448869.1分子后，乳腺癌細胞活力比對照組和Chidamide處理組明顯降低，Nestin的表達也受到抑制，表明，LncRNA ENST00000448869.1分子可以靶向調控Nestin的表達，從而增加Chidamide對乳腺癌MDA-MB-231細胞的藥理作用，抑制細胞生長。

Fig 4 Muse cell analysis for LncRNA-siRNA:siRNA 1,2,3 transfected into breast cancer cells respectively and incubated with Chidamide for 24 hours (n=3)

Fig 5 Assay for LncRNA mRNA expression induced by LncRNA siRNA1,2,3 transfected into breast cancer cells respectively and Nestin expression n=3)*P<0.05 vs Basal,##P<0.01 vs Chidamide.

3 討論

乳腺癌在全球范圍內女性癌癥中發病率和死亡率都很高，乳腺癌的發生不僅與遺傳和內分泌因素有關，還與LncRNA、miRNAs和蛋白質表達不當有關[9-10]。HDACi是一組有前景的抗癌藥物，通過改變染色質結構和基因表達，在誘導癌細胞凋亡和細胞周期停滯中具有潛在作用[11]。Chidamide作為新一代的HDACi，不會明顯增加化療的副作用[12]。我們將Chidamide與乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育，利用Muse自動細胞分析儀發現，Chidamide可以降低MDA-MB-231細胞活力，抑制細胞生長。

LncRNA被認為是最敏感和特異的癌癥生物標志物之一，在不同水平上參與各種癌癥的發展和進展，包括表觀遺傳、轉錄和轉錄后調節[13]。有研究表明，LncRNA是乳腺癌發展的關鍵調節因子，與控制自噬有關，因此識別與自噬相關的具有乳腺癌預后價值的LncRNA是至關重要的[13]。雖然已經報道了LncRNA通過介導轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)前轉移作用和調節上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)來調節腫瘤轉移，并且有些LncRNA轉錄物參與乳腺癌的發生，但是LncRNA在乳腺癌治療中的生物學作用還沒有得到很好的研究[14]。我們通過高通量測序聯合生物信息學軟件分析篩選出LncRNA ENST00000448869.1分子在經Chidamide作用后表達增高，我們進一步通過實時熒光定量PCR驗證了ENST00000448869.1的準確性。進一步的后續實驗可以檢測LncRNA ENST00000448869.1是否與細胞自噬相關。

Nestin是第VI型中間絲蛋白，實驗模型和人類樣本都表明Nestin在許多類型的腫瘤和一些其他的組織中的表達上調[15]。Nestin與腫瘤發生相關，因為它在癌癥組織中的表達高于正常組織，尤其在小腫瘤血管和基質癌細胞中Nestin出現高表達[16]。因此Nestin可以作為乳腺癌新血管生成的重要標志物。我們通過蛋白互作分析軟件的結果，說明LncRNA ENST00000448869.1分子與Nestin存在蛋白互作關系。我們通過Real-time PCR驗證了在Chidamide作用乳腺癌細胞后Nestin的mRNA表達增高。為了進一步驗證LncRNA ENST00000448869.1和Nestin在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的調控作用，我們設計了特異siRNA來靜默相關基因的轉錄。我們利用siRNA抑制LncRNA ENST0000044 8869.1分子的轉錄后，在Chidamide作用細胞時，siRNA明顯抑制了LncRNA的表達，同時在siRNA的作用下Nestin的mRNA和蛋白表達量也呈下降趨勢，與此同時細胞死亡率也隨之下降。這些結果說明了LncRNA ENST00000448869.1分子靶向調控Nestin的表達降低，可以抑制乳腺癌MDA-MB-231的細胞生長。

總之，我們的實驗只是初步證實了在Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231細胞后，可能存在LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之間的調控機制抑制乳腺癌細胞生長。LncRNA ENST0000044 8869.1和Nestin之間具體的作用機制需要進一步的實驗驗證。本研究為進一步的探索LncRNA ENST00000448869.1在乳腺癌細胞生長作用中的機制提供了實驗基礎。

(致謝：衷心感謝沈陽醫學院遼寧省環境污染與微生態重點實驗室為本實驗提供的實驗設備，感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協助。)