白屈菜堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠的改善作用及機(jī)制

李曉明 王文豹 郭麗娜 宋波 董巍 徐天嬌 王曉麗

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）23-2868-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.09

摘 要 目的：研究白屈菜堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠的改善作用及可能機(jī)制。方法：將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成正常對(duì)照組，模型組，白屈菜堿低、中、高劑量組（0.125、0.25、0.50 mg/kg）和陽性對(duì)照組（護(hù)肝片，0.42 g/kg），每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用腹腔注射四氯化碳-橄欖油溶液8周建立肝纖維化模型。于造模第5周開始，正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)10周。末次灌胃后，計(jì)算大鼠肝指數(shù);測定大鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、透明質(zhì)酸（HA）和肝組織中羥脯氨酸（Hyp）水平;觀察大鼠肝組織中膠原纖維蛋白染色情況;測定大鼠肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、p62蛋白表達(dá)水平和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平，以及上述蛋白對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)，血清中AST、ALT、HA、Hyp水平，肝組織中膠原纖維蛋白陽性染色面積百分比和α-SMA、LC3-Ⅱ的mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;p62蛋白表達(dá)水平，PI3K、Akt、mTOR的蛋白磷酸化水平以及p62、PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，白屈菜堿低劑量組大鼠PI3K、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05）;白屈菜堿中、高劑量組上述指標(biāo)（除中劑量組肝指數(shù)、HA水平外）的變化均被顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05）。結(jié)論：白屈菜堿對(duì)四氯化碳所致大鼠肝纖維化具有一定的改善作用;其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。

關(guān)鍵詞 白屈菜堿;肝纖維化;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路;自噬

Improvement Effects of Chelidonine on CCl4-induced Hepatic Fibrosis Model Rats and Its Mechanism

LI Xiaoming1，WANG Wenbao2，GUO Lina2，SONG Bo2，DONG Wei2，XU Tianjiao1，WANG Xiaoli2（1. Institute of Medicine， Qiqihar Medical College， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. School of Pharmacy， Qiqihar Medical College， Heilongjiang Qiqihar 161006， China）

ABSTRACT&nbsp; ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and potential mechanism of chelidonine on CCl4-induced hepatic fibrosis model rats. METHODS： According to the random number table method， a total of 48 rats were randomly divided into normal control group， model group， chelidonine low-dose， middle-dose and high-dose groups （0.125， 0.25， 0.50 mg/kg）， positive control group （Liver-protecting tablet，0.42 g/kg）， with 8 rats in each group. Except for normal control group， other groups were given CCl4-olive oil solution intraperitoneally for 8 weeks to induce hepatic fibrosis model. From the fifth week of modeling， normal control group and model group were given water intragastrically; administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 10 weeks. After last intragastric administration， hepatic index of rats was calculated. The levels of aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT） and hyaluronic acid （HA） in serum and the level of hydroxyproline （Hyp） in liver tissue were determined. The staining of collagen fibrin in rat liver was observed. The protein expression of α-smooth muscle actin （α-SMA），microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） and p62 as well as the phosphorylation level of phosphoinositide 3 kinase （PI3K），protein kinase B （Akt） and mammalian target of rapamycin （mTOR） in liver tissue were determined; mRNA expression corresponding to above protein were also determined. RESULTS： Compared with normal control group， the hepatic index， the serum levels of AST， ALT， HA and Hyp， the percentage of positive staining area for collagen fibrin， the mRNA and protein expression of α-SMA and LC3-Ⅱ were increased significantly （P<0.05）. Protein expression of p62， phosphorylation levels of PI3K， Akt and mTOR as well as mRNA expression of p62， PI3K， Akt and mTOR were significantly down-regulated （P<0.05）. Compared with model group， phosphorylation levels of PI3K and mTOR were decreased significantly in chelidonine low-dose group （P<0.05）. The changes of above indexes in chelidonine middle-dose and high-dose groups （except for liver index， HA level in middle-dose group） were reversed significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Chelidonine can attenuate CCl4-induced liver fibrosis in rats; the mechanism of it may be associated with activating PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and inhibiting autophagy.

KEYWORDS? ?Chelidonine; Hepatic fibrosis; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Autophagy

肝纖維化是由多種原因?qū)е碌募毙曰蚵愿尾〉墓餐±磉^程，如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝以及自身免疫性疾病等均可引起肝組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化[1-2]。肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，會(huì)刺激肝星狀細(xì)胞（HSC）活化，進(jìn)而分泌α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白等ECM，加快肝纖維化進(jìn)程，甚至?xí)l(fā)展成為肝硬化-肝細(xì)胞癌;若肝臟在發(fā)生纖維化時(shí)經(jīng)過積極治療，可終止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的病理學(xué)改變[3-4]。細(xì)胞自噬是通過自我消化受損的細(xì)胞器等來維持細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的穩(wěn)定，可為HSC提供能量，促進(jìn)HSC的活化、增殖，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[5]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在肝纖維化的進(jìn)程中扮演著重要角色，其中mTOR是PI3K和Akt下游的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也是自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，因此可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[6]。

白屈菜為罌粟科白屈菜屬多年生草本植物白屈菜Chelidonium majus L.的全草，味苦，性涼，有小毒，歸肺、心、腎經(jīng)，具有鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、消腫之功效[7]。白屈菜堿是中藥白屈菜中的主要活性成分之一[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白屈菜堿具有抗纖維化、抗炎、抗腫瘤、抗菌、鎮(zhèn)痛、解痙等多種藥理作用[9]，尤其是其抗纖維化、抗腫瘤作用，近年受到了越來越多學(xué)者的關(guān)注。相關(guān)研究顯示，白屈菜堿可調(diào)節(jié)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等肝酶活性，抑制大鼠肝纖維化[10]。本課題組前期研究也表明，白屈菜堿對(duì)活化的大鼠HSC——CFSC-8B細(xì)胞的增殖和細(xì)胞中的膠原合成具有抑制作用[11]。但目前關(guān)于白屈菜堿抗肝纖維化的作用機(jī)制尚未完全闡明。鑒于此，本研究擬以四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型，探討白屈菜堿的抗肝纖維化作用及其對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和自噬的調(diào)控作用，為進(jìn)一步闡明白屈菜堿抗肝纖維化的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Stratagene Mx3005P型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Agilent公司），JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽、JY-CZ1型單垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、SmartChemiTM Ⅱ型一體式化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）、ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）、XPE504型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑包括：白屈菜堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)18041303，純度≥98%），護(hù)肝片（黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)201609128，規(guī)格為每片0.35 g），苦味酸-酸性品紅（VG）染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為20161121、20160519），透明質(zhì)酸（HA）檢測試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司，批號(hào)201709），肝組織羥脯氨酸（Hyp）檢測試劑盒、ALT檢測試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒、兔抗鼠p62多克隆抗體（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20180103、20171220、20171216、20200113），PrimeScript RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)AJ10935A]，細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、兔抗鼠Akt多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為052720200827、033018200921、033018200921），TRIzol試劑（美國Ambion公司，批號(hào)229009），兔抗鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）多克隆抗體（美國Abcam公司，批號(hào)GR219724-1），兔抗鼠α-SMA多克隆抗體、兔抗鼠PI3K多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化PI3K（p-PI3K）多克隆抗體、兔抗鼠mTOR多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化TOR（p-mTOR）多克隆抗體、兔抗鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號(hào)分別為19245、4257、4228、2983、2974、2118S），生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、ECL超敏發(fā)光檢測試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)分別為00051405、40532），歐麗薇蘭橄欖油（益海嘉里食品營銷有限公司，批號(hào)F20160814）;PCR實(shí)驗(yàn)中引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余試劑均為分析純，水為自制雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，共48只，5～6周齡，體質(zhì)量為（180±10） g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（黑）- 2016-001。全部大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，實(shí)驗(yàn)室溫度為20～25 ℃，12 h照明/12 h黑暗交替。大鼠飼養(yǎng)期間常規(guī)進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，白屈菜堿低、中、高劑量組（0.125、0.25、0.50? ?mg/kg，劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定）和陽性對(duì)照組 （護(hù)肝片，0.42 g/kg[12]），每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用腹腔注射CCl4-橄欖油溶液誘導(dǎo)建立肝纖維化模型（造模前禁食12 h）。本研究所用的造模方法是在文獻(xiàn)[13]的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)后得到，具體為：造模大鼠首次按8 mL/kg的劑量腹腔注射50%CCl4-橄欖油溶液，之后均繼續(xù)以5 mL/kg的劑量注射，每3天1次，持續(xù)8周。于造模第5周開始，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（均以水溶解），正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃水，灌胃體積均為1 mL，每天1次，連續(xù)10周。

2.2 樣本采集與處理

于第14周末次灌胃后，大鼠禁食不禁水24 h，稱其體質(zhì)量后以乙醚麻醉，于股動(dòng)脈取血。將血液以3 000? r/min離心5 min，收集上層血清，備用。將大鼠處死，摘取其肝組織并稱定質(zhì)量，然后于冰盒上取一小塊肝組織并置于4%甲醛溶液中固定24 h，用于病理組織學(xué)檢查;將一部分肝組織置于液氮中快速凍存，用于Western blot和PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)檢測;剩余肝組織直接用于Hyp水平測定。

2.3 肝指數(shù)測定

根據(jù)大鼠體質(zhì)量和肝組織質(zhì)量計(jì)算大鼠肝指數(shù)：肝指數(shù)（%）=肝組織質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.4 血清中AST、ALT和HA水平測定

取“2.2”項(xiàng)下血清適量，分別按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，測定大鼠血清中AST、ALT和HA水平。

2.5 肝組織中Hyp水平測定

取“2.2”項(xiàng)下肝組織，參照文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行處理后，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，測定大鼠肝組織中Hyp水平。

2.6 肝組織中膠原纖維蛋白表達(dá)情況觀察

取“2.2”項(xiàng)下于甲醛溶液中固定24 h后的肝組織，常規(guī)制備石蠟切片（厚度約3 μm），經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水后，按照VG染色試劑盒說明書方法對(duì)切片進(jìn)行染色（VG陽性染色呈鮮紅色）。將切片置于倒置顯微鏡下觀察、拍照，利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算膠原纖維蛋白陽性染色面積和染色總面積，并計(jì)算膠原纖維蛋白陽性染色面積百分比（膠原纖維蛋白陽性染色面積/染色總面積×100%）。結(jié)果處理時(shí)，以正常對(duì)照組數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)（100%）計(jì)算其余各組結(jié)果的相對(duì)值。

2.7 肝組織中α-SMA、LC3-Ⅱ、p62的蛋白表達(dá)水平和PI3K、Akt、mTOR的蛋白磷酸化水平測定

采用Western blot法進(jìn)行測定。取“2.2”項(xiàng)下凍存的肝組織，于冰上常規(guī)解凍后，按細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書方法提取肝組織中的總蛋白。采用BCA法測定總蛋白濃度后，煮沸5 min使其變性。取變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（濃縮膠電壓75 V、電泳時(shí)間30 min，分離膠電壓110 V、電泳時(shí)間90 min），然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上（電流350 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2 h），加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，于4 ℃封閉過夜;分別加入α-SMA、LC3、p62、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPGH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于37 ℃孵育4 h;以TBST洗膜3次、每次10 min，然后加入生物素標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例1 ∶ 1 000），于37 ℃孵育2 h;以TBST洗膜3次、每次10 min，然后加入ECL熒光檢測劑，采用一體式化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶的灰度值。以α-SMA、LC3-Ⅱ、p62與內(nèi)參GAPDH的蛋白條帶灰度值的比值表示這3種蛋白的表達(dá)水平，以p-PI3K與PI3K、p-Akt與Akt、p-mTOR與mTOR的蛋白條帶灰度值的比值表示這3種蛋白的磷酸化水平。

2.8 肝組織中α-SMA、LC3-Ⅱ、p62、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)水平測定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行測定。取“2.2”項(xiàng)下凍存的肝組織，于冰上常規(guī)解凍后，采用TRIzol試劑提取肝組織中總RNA，然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度見表1）。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，dNTP溶液1.6 μL，上、下游引物各0.8 μL， BeyoTaq Buffer 2 μL，BeyoTaq DNA Polymerase 0.1 μL，加雙蒸水至總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行溶解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算肝組織中α-SMA、LC3、p62、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)水平（公式中Ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)），并以正常對(duì)照組數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)（1.00）計(jì)算其余各組結(jié)果的相對(duì)值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT、HA水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT、HA水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，白屈菜堿中劑量組大鼠血清中AST、ALT水平均顯著降低（P<0.05）;白屈菜堿高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT、HA水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT、HA水平測定結(jié)果見表2。

3.2 大鼠肝組織中Hyp水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中Hyp水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，白屈菜堿中、高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠肝組織中Hyp水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肝組織中Hyp水平測定結(jié)果見表3。

3.3 大鼠肝組織中纖維蛋白染色情況

正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)及中央靜脈周圍無纖維增生。模型組大鼠肝組織匯管區(qū)擴(kuò)大，膠原纖維大量增生。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織匯管區(qū)不同程度地縮小，膠原沉積不同程度地減少;其中白屈菜堿高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍僅有極少量的膠原沉積。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中膠原纖維蛋白陽性染色面積百分比顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，白屈菜堿中、高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠肝組織中膠原纖維蛋白陽性染色面積百分比均顯著降低（P<0.05） 。各組大鼠肝組織中膠原纖維蛋白染色顯微圖見圖1，膠原纖維蛋白陽性染色面積百分比測定結(jié)果見表3。

3.4 大鼠肝組織中α-SMA、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），p62蛋白表達(dá)水平和PI3K、Akt、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，白屈菜堿低劑量組大鼠肝組織中PI3K、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.05） ;白屈菜堿中、高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠肝組織中α-SMA、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），p62蛋白表達(dá)水平和PI3K、Akt、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肝組織中α-SMA、LC3-Ⅱ、p62和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平或磷酸化水平測定結(jié)果見表4。

3.5 大鼠肝組織中α-SMA、LC3、p62和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、LC3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），p62、PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，白屈菜堿中、高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠肝組織中α-SMA、LC3 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），p62、PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肝組織中α-SMA、LC3、p62和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果見表5。

4 討論

CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，可在肝臟中生成三氯甲基自由基和氯自由基，進(jìn)而溶解肝細(xì)胞膜，使肝細(xì)胞中大量肝內(nèi)酶（AST、ALT等）滲入血液，造成肝損傷和肝纖維化[15]。因此，本研究選擇腹腔注射CCl4-橄欖油溶液來建立大鼠肝纖維化模型。護(hù)肝片具有保護(hù)肝損傷的作用，在肝損傷相關(guān)研究中常用作陽性對(duì)照藥物進(jìn)行對(duì)照觀察[16-17]。

血清中肝內(nèi)酶（AST、ALT）水平是評(píng)價(jià)肝損傷和肝纖維化程度的重要指標(biāo)，輕度的肝細(xì)胞損傷即可使血液中肝內(nèi)酶的濃度增加數(shù)倍[18]。肝損傷后會(huì)導(dǎo)致組織中HSC激活并合成α-SMA，產(chǎn)生大量以膠原蛋白為主的ECM沉積。Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸，HA是ECM中糖胺聚糖的主要成分，隨著ECM的不斷沉積，肝組織中Hyp、HA含量也隨之增加，因此檢測肝組織中α-SMA、Hyp、HA水平對(duì)于判斷肝組織損傷和肝纖維化程度具有重要意義[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT水平以及肝組織中α-SMA、Hyp、HA水平較正常對(duì)照組均顯著升高，肝組織纖維化明顯，表明肝纖維化大鼠模型制備成功。當(dāng)給予不同劑量白屈菜堿處理后，大鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT水平以及肝組織中α-SMA（mRNA及其蛋白表達(dá)）、Hyp、HA水平較模型組均不同程度地降低，肝組織纖維化程度減輕，說明白屈菜堿對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化損傷具有較好的改善作用。

肝內(nèi)自噬是肝細(xì)胞對(duì)自身結(jié)構(gòu)蛋白及細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種方式，在肝纖維化損傷中具有重要作用[20-21]。自噬可以通過分解、減少脂滴而促進(jìn)HSC活化[22]。Thoen等[23]用3-甲基腺嘌呤抑制HSC自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和體積明顯增加、脂肪酸合成明顯減弱，HSC的活化受到抑制。上述結(jié)果提示，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，可抑制HSC活化，進(jìn)而抑制肝纖維化。自噬相關(guān)蛋白LC3在自噬小體的形成中具有重要作用，是細(xì)胞自噬的特異性標(biāo)志物[24]。LC3可分為Ⅰ型（LC3-Ⅰ）和Ⅱ型（LC3-Ⅱ），當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄訪C3-Ⅰ;LC3-Ⅰ被自噬相關(guān)蛋白Atg7識(shí)別并活化后，再經(jīng)泛素化加工修飾生成LC3-Ⅱ——LC3-Ⅱ的表達(dá)水平與自噬體數(shù)量成正比，且LC3-Ⅱ在自噬過程的晚期階段表達(dá)，因此常作為反映自噬強(qiáng)度的指標(biāo)[25]。p62蛋白作為自噬降解的底物之一，也是反映自噬水平的重要指標(biāo)[26]。本研究結(jié)果顯示，給予不同劑量白屈菜堿處理后，肝纖維化模型大鼠肝組織中LC3 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平均不同程度地降低，p62 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平均不同程度地升高，提示白屈菜堿能夠?qū)Ω蝺?nèi)自噬產(chǎn)生影響。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在自噬過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其中PI3K是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的復(fù)合體，是該信號(hào)通路的重要組成部分[27]。激活的PI3K（即p-PI3K）會(huì)將磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3再將目標(biāo)蛋白Akt募集到細(xì)胞膜上，進(jìn)而磷酸化激活A(yù)kt分子;激活后的Akt分子再磷酸化激活下游的mTOR;而mTOR是抑制自噬過程的關(guān)鍵蛋白，可阻礙自噬小體的形成，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬[28]。本研究結(jié)果顯示，給予不同劑量白屈菜堿處理后，肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、Akt、mTOR的蛋白磷酸化水平及相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平均不同程度地升高。這表明白屈菜堿能夠調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)基因mRNA及其蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、p62的表達(dá)，阻止HSC的活化，并抑制肝纖維化的發(fā)生。

綜上所述，白屈菜堿可改善CCl4誘導(dǎo)大鼠的肝纖維化，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。然而，自噬是一把“雙刃劍”，其與肝纖維化的關(guān)系復(fù)雜。因此，白屈菜堿通過調(diào)控自噬抗肝纖維化的作用機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] EZHILARASAN D，SOKAL E，NAJIMI M. Hepatic fibrosis：it is time to go with hepatic stellate cell-specific therapeutic targets[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2018，17（3）：192-197.

[ 2 ] CHEN G，XIA B，F(xiàn)U Q，et al. Matrix mechanics as regulatory factors and therapeutic targets in hepatic fibrosis[J]. Int J Biol Sci，2019，15（12）：2509-2521.

[ 3 ] WANG S，F(xiàn)RIEDMAN S L. Hepatic fibrosis：a convergent response to liver injury that is reversible[J]. J Hepatol，2020，73（1）：210-211.

[ 4 ] CUI Z，HUANG N，LIU L，et al. Dynamic analysis of m6A methylation spectroscopy during progression and reversal of hepatic fibrosis[J]. Epigenomics，2020，12（19）：1707-1723.

[ 5 ] HU Z，SU H，ZENG Y，et al. Tetramethylpyrazine ameliorates hepatic fibrosis through autophagy-mediated inflammation[J]. Biochem Cell Biol，2020，98（3）：327-337.

[ 6 ] ZHANG Z，WEN H，WENG J，et al. Silencing of EPCAM suppresses hepatic fibrosis and hepatic stellate cell proli- feration in mice with alcoholic hepatitis via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Cell Cycle，2019，18（18）：2239-2254.

[ 7 ] 王曉麗，郭麗娜，孫輯凱，等.齊齊哈爾地區(qū)野生白屈菜質(zhì)量考察研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（14）：2031-2032.

[ 8 ] PAN J，YANG Y，ZHANG R，et al. Enrichment of chelidonine from Chelidonium majus L. using macroporous resin and its antifungal activity[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2017，1070：7-14.

[ 9 ] HOU F J，GUO L X，ZHENG K Y，et al. Chelidonine enhances the antitumor effect of lenvatinib on hepatocellular carcinoma cells[J].Onco Targets Ther，2019，12：6685- 6697.

[10] LIU X W，TANG C L，ZHENG H，et al. Investigation of the hepatoprotective effect of Corydalis saxicola Bunting on carbon tetrachlorideinduced liver fibrosis in rats by 1H-NMR-based metabonomics and network pharmaco-? ?logy approaches[J]. J Pharm Biomed Anal，2018，159：252-261.

[11] 李曉明，林鵬飛，董妙先，等.白屈菜堿對(duì)活化后大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B的增殖、膠原合成及TGF-β1受體的影響[J].中國藥房，2019，30（13）：1759-1763.

[12] 梁增榮，龍梓，陳少銳，等.護(hù)肝片對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝損傷肝陰虛證的保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（24）：137-141.

[13] 龍丹丹，張清，占凱，等.大黃素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的干預(yù)作用[J].廣西醫(yī)學(xué)，2020，42（16）：2120-2124.

[14] 李曉明，歐陽婷庭，董妙先，等.白屈菜紅堿對(duì)肝纖維化小鼠TGF-β/Smads信號(hào)通路的影響[J].中國病理生理雜志，2018，34（7）：1323-1328.

[15] WU B M，LIU J D，LI Y H，et al. Margatoxin mitigates CCl4-induced hepatic fibrosis in mice via macrophage polarization，cytokine secretion and STAT signaling[J]. Int J Mol Med，2020，45（1）：103-114.

[16] 李娜，周琪，趙鑫，等.大蒜素對(duì)小鼠酒精性肝纖維化的預(yù)防作用研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（6）：177-181.

[17] 齊玉梅，呼和木仁.額力根-Ⅱ號(hào)對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2016，22（12）：32-34.

[18] WONG R J，LE A，NGUYEN M T，et al. Significant hepatic fibrosis among treatment-naive chronic hepatitis B virus with increased hepatitis B virus DNA and normal? ?alanine aminotransferase[J]. Clin Gastroenterol Hepatol，2018，16（1）：146-148.

[19] 柯迎妹，江敏，周樹波，等.蘭坪蟲草多糖組分分析及緩解小鼠肝纖維化研究[J].中國中藥雜志，2020，45（21）：5256-5264.

[20] GE M，LIU H，ZHANG Y，et al. The anti-hepatic fibrosis effects of dihydrotanshinone Ⅰ are mediated by disrup- ting the yes-associated protein and transcriptional enhancer factor D2 complex and stimulating autophagy[J]. Br J Pharmacol，2017，174（10）：1147-1160.

[21] HUANG Y，LI Y，LOU A，et al. Alamandine attenuates hepatic fibrosis by regulating autophagy induced by NOX4- dependent ROS[J]. Clin Sci （Lond），2020，134（7）：853- 869.

[22] LU C F，XU W X，ZHANG F，et al. Nrf2 knockdown attenuates the ameliorative effects of ligustrazine on hepatic fibrosis by targeting hepatic stellate cell transdifferentiation[J]. Toxicology，2016，365：35-47.

[23] THOEN L F，GUIMARAES E L，DOLLE L，et al. A role for autophagy during hepatic stellate cell activation[J]. J Hepatol，2011，55（6）：1353-1360.

[24] SONG M，ZHANG H，CHEN Z，et al. Shikonin reduces hepatic fibrosis by inducing apoptosis and inhibiting autophagy via the platelet-activating factor-mitogen-activated protein kinase axis[J]. Exp Ther Med，2021，21（1）：28.

[25] GóMEZ-SáNCHEZ R，YAKHINE-DIOP S M，RODRíGUEZ-ARRIBAS M，et al. mRNA and protein dataset of autophagy markers （LC3 and p62） in several cell lines[J]. Data Brief，2016，7：641-647.

[26] LIAN C，ZHAO Y，SUN J，et al. Role of cell autophagy? in the generation of IgM and hepatic fibrosis in primary? ? ?biliary cholangitis[J]. Clin Rheumatol，2020，39（11）：3499-3506.

[27] DONG Z，LI S，WANG X，et al. IncRNA GAS5 restrains CCl4-induced hepatic fibrosis by targeting miR-23a through the PTEN/PI3K/Akt signaling pathway[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2019，316（4）：G539- G550.

[28] KIM Y C，GUAN K L. mTOR：a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. J Clin Invest，2015，125（1）：25-32.

（收稿日期：2021-05-25 修回日期：2021-10-20）

（編輯：林 靜）