槲皮素對人宮頸鱗癌順鉑耐藥細胞 SiHa/DDP的逆轉作用研究

馮磊 楊建敏 楊然 孫麗 董莉麗 張清偉

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）23-2875-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.10

摘 要 目的：研究槲皮素對人宮頸鱗癌順鉑耐藥細胞SiHa/DDP的逆轉作用。方法：測定順鉑對SiHa/DDP細胞的耐藥指數以及槲皮素對SiHa/DDP細胞的逆轉耐藥倍數;考察槲皮素（0.005 μg/mL）、順鉑（2.5 μg/mL）、順鉑聯合槲皮素（2.5 μg/mL順鉑+0.005? ? μg/mL槲皮素）、槲皮素聯合通路抑制劑（0.005 μg/mL槲皮素+20 nmol/L雷帕霉素）對SiHa/DDP細胞凋亡率及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路相關蛋白[PI3K、Akt、mTOR、腫瘤多藥耐藥蛋白（P-gp）、p70核糖體S6激酶（p70S6K）]表達的影響。結果：順鉑對SiHa/DDP細胞的耐藥指數為5.19，槲皮素對SiHa/DDP細胞的逆轉耐藥倍數為4.00。與單用順鉑和單用槲皮素比較，順鉑聯合槲皮素、槲皮素聯合雷帕霉素均可顯著升高SiHa/DDP細胞的凋亡率（P<0.05），顯著降低Akt、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平和P-gp蛋白的表達水平（P<0.05）。結論：槲皮素可逆轉SiHa/DDP細胞對順鉑的耐藥性，其作用機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達有關。

關鍵詞 槲皮素;宮頸鱗癌;SiHa/DDP細胞;PI3K/Akt/mTOR信號通路;耐藥性;逆轉

Study on Reversal Effect of Quercetin on Human Cervical Squamous Carcinoma Cisplatin-resistant Cell Line SiHa/DDP

FENG Lei1，YANG Jianmin1，YANG Ran1，SUN Li1，DONG Lili1，ZHANG Qingwei2（1. Dept. of Gynaecology， Nanyang Municipal Central Hospital， Henan Nanyang 473000， China; 2. Dept. of Gynaecology， the First Affiliated Hospital of Luohe Medical College， Henan Luohe 462000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the reversal effect of quercetin on human cervical squamous carcinoma cisplatin-resistant cell line SiHa/DDP. METHODS： The drug resistance index of cisplatin to SiHa/DDP cells， and the reversal resistance multiple of quercetin to SiHa/DDP cells were determined. The effects of quercetin （0.005 μg/mL）， cisplatin （2.5 μg/mL）， cisplatin combined with quercetin （2.5 μg/mL cisplatin+0.005 μg/mL quercetin）， quercetin combined with pathway inhibitor （0.005 μg/mL quercetin+20 nmol/L rapamycin） on the apoptotic rate of SiHa/DDP cells were investigated， as well as its effects on the expression of phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B（Akt）/mammalian rapamycin target protein （mTOR） signaling pathway related proteins （PI3K， Akt， mTOR， P-gp， p70S6K）. RESULTS： The resistance index of cisplatin to SiHa/DDP cells was 5.19， and reversal resistance multiple of quercetin to SiHa/DDP cells was 4.00. Compared with cisplatin alone and quercetin alone， cisplatin combined with quercetin， quercetin combined with rapamycin could significantly increase the apoptotic rate of SiHa/DDP cells （P<0.05）， while decreased the phosphorylation of Akt， mTOR and p70S6K protein as well as the expression of P-gp protein （P<0.05）. CONCLUSIONS： Quercetin can effectively reverse drug resistance of SiHa/DDP cells to cisplatin， which may be associated with inhibiting the expression of the protein related to PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

KEYWORDS? ?Quercetin; Cervical squamous carcinoma; SiHa/DDP cells; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Drug resistance; Reversal

宮頸癌是較常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展與人乳頭瘤病毒（HPV）密切相關;在宮頸癌的病理分類中，宮頸鱗癌是最主要的類型，約占80%[1]。有研究提示，以順鉑為基礎的輔助化療對宮頸鱗癌的副作用小、療效確切，可改善患者局部病灶，提高患者生存率;但順鉑易產生耐藥性，降低腫瘤化療的效果[2]。相關研究發現，在多數耐藥腫瘤細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路常處于異常激活的狀態[3]。PI3K/Akt/mTOR信 號通路相關蛋白是調控細胞增殖及分裂的關鍵信號分子，可影響腫瘤多藥耐藥蛋白（P-gp）、p70核糖體S6激酶（p70S6K）等蛋白的表達，從而激活腫瘤細胞的耐藥作用[4-5]。

槲皮素是黃酮類化合物，對多種惡性腫瘤均具有抑制作用，可促進腫瘤細胞凋亡，抑制其遷移和侵襲，同時還可增加腫瘤細胞對化療的敏感性[3]。但槲皮素是否可逆轉宮頸癌細胞的耐藥性，尚不明確。為此，本研究基于PI3K/Akt/mTOR信號通路探討槲皮素對人宮頸鱗癌順鉑耐藥細胞 SiHa/DDP的逆轉作用，以期為宮頸癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用MR-96A型自動酶標儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，CytoFLEX型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，DGENETM型自動電泳凝膠成像分析儀購自日本Olympus公司，CCL-170B-8型細胞培養箱購自上海必寶生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用DMEM 培養基、胎牛血清（批號分別為17M483、1967839）購自美國Gibco公司;青霉素-鏈霉素溶液、CCK-8試劑、AnnexinⅤ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號分別為1936917、C0038、C1062L、P0012）均購自上海碧云天生物技術有限公司;順鉑（批號H37021358）購自山東齊魯制藥有限公司;槲皮素、兔抗小鼠Akt單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化Akt（p-Akt）單克隆抗體、兔抗小鼠mTOR 單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化mTOR（p-mTOR）單克隆抗體（批號分別為Q4951、SAB4500796、SAB4504331、SAB4501038、SAB4504476） 均購自美國Sigma公司;兔抗小鼠p70S6K單克隆抗體、兔抗小鼠P-pg單克隆抗體、兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體（批號分別為14485-1-AP、2236-1-AP、16825-1-AP）均購自美國Proteintech公司;兔抗小鼠磷酸化p70S6K（p-p70S6K）多克隆抗體（批號RS-2602R）購自美國Cell Signaling公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（二抗）（批號20000258）購自美國CST公司;高效ECL顯色試劑（批號1515601）購自美國Millipore公司;雷帕霉素（批號H12J10J79598，純度99%）購自上海源葉生物科技有限公司;其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 細胞

人宮頸鱗癌細胞SiHa 購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，人宮頸鱗癌順鉑耐藥細胞 SiHa /DDP購自湖南豐暉生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養

將SiHa細胞和SiHa/DDP細胞以含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基（以下簡稱“完全培養基”），于37 ℃、5%CO2的培養箱中進行常規培養。在細胞狀態良好、融合度達80%～90%時，以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，進行傳代。取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.2 SiHa/DDP細胞的耐藥指數檢測

采用CCK-8法進行檢測。取對數生長期的SiHa細胞和SiHa/DDP細胞，按2×105 mL-1接種于96孔板中，每孔100 μL，常規培養12 h后，將細胞分為對照組和不同濃度順鉑組（順鉑終質量濃度分別為 0.625、1.25、2.5、5、7.5 μg/mL，參考文獻[6]設置），每組設5個復孔。對照組加入完全培養基200 μL，不同濃度順鉑組加入含相應質量濃度順鉑的完全培養基100 μL，常規培養24 h;棄去培養基，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，于室溫孵育2 h后，采用酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔光密度（OD）值。計算細胞抑制率[細胞抑制率=（對照組OD值-給藥組OD值）/對照組OD值×100%]和順鉑的半抑制濃度（IC50），再在此基礎上計算SiHa/DDP細胞的耐藥指數（耐藥指數=SiHa/DDP細胞的IC50/SiHa細胞的IC50]。

2.3 槲皮素對SiHa/DDP細胞的耐藥逆轉作用考察

2.3.1 槲皮素對SiHa細胞、SiHa/DDP細胞的抑制作用考察 采用CCK-8法進行考察。取對數生長期的SiHa細胞和SiHa/DDP細胞，按2×105 mL-1接種于96孔板中，每孔100 μL，常規培養12 h后，將兩種細胞均分別分為對照組、不同濃度槲皮素組（槲皮素的終質量濃度分別為 0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 μg/mL，參考文獻[6]設置），每組設5個復孔。對照組加入200 μL完全培養基，不同濃度槲皮素組加入含相應質量濃度槲皮素的完全培養基100 μL，常規培養24 h;棄去培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于室溫孵育2 h后，采用酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔OD值，按“2.2”項下方法計算槲皮素對SiHa、SiHa/DDP細胞的抑制率。

2.3.2 槲皮素對SiHa/DDP細胞的逆轉耐藥倍數檢測 采用CCK-8法進行檢測。取對數生長期的SiHa/DDP細胞，按2×105 mL-1接種于96孔板中，每孔100 μL，常規培養12 h后，將細胞分為對照組、不同濃度順鉑組、順鉑+不同濃度槲皮素組，每組設5個復孔。對照組加入完全培養基200 μL，不同濃度順鉑組加入含順鉑的完全培養基100 μL（順鉑終質量濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、7.5 μg/mL），順鉑+不同濃度槲皮素組加入含順鉑和槲皮素的完全培養基100 μL（固定順鉑的終質量濃度為 2.5? μg/mL，槲皮素的終質量濃度分別為0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 μg/mL，參考“2.2”項下結果以及預實驗結果設置），常規培養24 h;棄去培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于室溫孵育2 h后，采用酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔OD值，按“2.2”項下方法計算細胞抑制率和藥物的IC50，并計算槲皮素對SiHa/DDP細胞的逆轉耐藥倍數[逆轉耐藥倍數=順鉑組的IC50/（順鉑+不同濃度槲皮素組的IC50）][7-8]。

2.4 槲皮素對SiHa/DDP細胞凋亡率的影響考察

取對數生長期的SiHa/DDP細胞，按2×105 mL-1接種于96孔板中，每孔100 μL，常規培養12 h后，將細胞分為對照組、槲皮素組（0.005 μg/mL）、順鉑組（2.5 μg/mL）、順鉑+槲皮素組（2.5 μg/mL順鉑+0.005 μg/mL槲皮素）、槲皮素+通路抑制劑組（0.005 μg/mL槲皮素+20 nmol/L雷帕霉素），每組設5個復孔。各組給藥濃度參考預實驗結果設置。對照組加入完全培養基200 μL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養基200 μL，常規培養24 h;收集細胞，以4 ℃的PBS洗滌2次，并調整細胞密度為1×105 mL-1，以1 000 r/min 離心5 min;棄上清液，下層細胞加入Annexin Ⅴ-FITC結合液重懸;取細胞懸液100 μL，加入Annexin Ⅴ-FITC試劑5 μL以及碘化吡啶10 μL，于室溫避光孵育15 min后，加入PBS至500 μL，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2.5 槲皮素對SiHa/DDP細胞中Akt、mTOR、p70S6K、P-gp蛋白表達的影響考察

采用Western bolt法進行考察。取對數生長期的SiHa/DDP細胞，按2×105 mL-1接種于96孔板中，每孔100 μL，常規培養12 h后，按“2.4”項下方法分組、給藥和培養，每組設3個復孔。收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min 后收集總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白煮沸10 min進行變性，然后取50 μg變性蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳;轉膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入 Akt（稀釋度為1 ∶? ?1 000）、p-Akt（稀釋度為1 ∶ 1 000）、 mTOR（稀釋度為 1 ∶ 1 000）、p-mTOR（稀釋度為1 ∶ 1 000）、p-p70S6K（稀釋度為1 ∶ 1 000）、p70S6K（稀釋度為1 ∶ 2 000）、P-gp（稀釋度為1 ∶ 1 000）、GAPDH （稀釋度為1 ∶ 2 000）一抗，于4 ℃下孵育過夜;以PBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入相應二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），于室溫孵育 2 h;以PBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入ECL顯色試劑顯色，置于凝膠成像分析儀中成像。采用Image J v1.7.0軟件分析，以p-Akt與Akt、p-mTOR與mTOR、p-p70S6K與p70S6K的灰度值比值分別表示Akt、mTOR、p70S6K的蛋白磷酸化水平，以P-gp與內參GAPDH的灰度值比值表示P-gp蛋白的表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 SiHa/DDP細胞的耐藥指數

順鉑對SiHa/DDP細胞的IC50為14.81 μg/mL，顯著高于其對SiHa細胞的IC50（2.86 μg/mL，P<0.01）;SiHa/DDP細胞的耐藥指數為5.19。

3.2 槲皮素對SiHa/DDP細胞的耐藥逆轉作用

不同濃度的槲皮素對SiHa細胞和SiHa/DDP細胞均具有抑制作用，且細胞抑制率隨著槲皮素濃度的增加呈逐漸升高的趨勢。另外，與同一劑量作用于SiHa細胞比較，槲皮素（0.005～0.025 μg/mL除外）對SiHa/DDP細胞的抑制作用顯著增強（P<0.05或 P<0.01），結果見表1。另經計算，順鉑聯合槲皮素對SiHa/DDP細胞的IC50為3.71 μg/mL，槲皮素的逆轉耐藥倍數為4.00。

3.3 槲皮素對SiHa/DDP細胞凋亡的影響

與對照組比較，槲皮素組、順鉑組、順鉑+槲皮素組、槲皮素+通路抑制劑組的細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）;與槲皮素組和順鉑組分別比較，順鉑+槲皮素組、槲皮素+通路抑制劑組的細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。結果見圖1、表2。

3.4 槲皮素對SiHa/DDP細胞中Akt、mTOR、p70S6K、P-gp蛋白表達的影響

與對照組比較，槲皮素組細胞中Akt、mTOR、p70S6K、P-gp蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）;與槲皮素組和順鉑組分別比較，順鉑+槲皮素組、槲皮素+通路抑制劑組細胞中上述蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）。結果見圖2、表3。

4 討論

宮頸癌是世界范圍內對女性影響最大的常見惡性腫瘤之一，嚴重影響女性生命健康和生活質量。在宮頸癌患者群體中，約13%的患者在疾病晚期才得到診斷，從而大大降低了患者生存率[9]。順鉑作為治療宮頸癌最常用的治療藥物之一，在臨床上得到了廣泛的應用，然而耐藥性卻嚴重影響其治療質量[10]。宮頸癌細胞可以通過很多途徑對順鉑產生耐藥，例如降低順鉑的攝入并增加外排，對抗順鉑對DNA的損傷作用以及抑制細胞凋亡信號通路等[11]。相關研究發現，天然藥物中的成分不僅可以單獨產生抗腫瘤作用，還可與順鉑產生協同作用，逆轉腫瘤細胞對順鉑產生的耐藥作用：黃芪多糖和順鉑聯用可降低肺癌細胞對順鉑的耐藥性[12];柚皮苷和順鉑聯用可大大提高順鉑對耐藥A549/DDP細胞株的抑制作用[13]。因此，聯合用藥為解決順鉑耐藥性的問題提供了新的思路。

劉玉瓊[14]研究發現，青蒿素能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，抑制宮頸癌細胞的擴散;王書惠等[15]研究發現，紫草素能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路活性，誘導宮頸癌細胞的凋亡和自噬，從而抑制宮頸癌細胞增殖。由此可知，PI3K/Akt/mTOR信號通路對宮頸癌的發生、發展具有重要影響。

有研究發現，槲皮素可通過多條信號通路抑制宮頸癌細胞的增殖，并促進其凋亡[16-19];還能大大降低乳腺癌MCF-7細胞對阿霉素的耐藥性，并抑制耐藥相關蛋白的活性[20-21]。但目前關于槲皮素逆轉宮頸癌耐藥方面的研究較少。基于此，本研究探討了槲皮素對人宮頸鱗癌順鉑耐藥細胞 SiHa/DDP的逆轉作用。結果顯示，槲皮素對SiHa/DDP細胞具有抑制作用，且呈一定的濃度依賴趨勢，提示槲皮素單獨應用可對SiHa/DDP細胞產生一定的抑制作用。進一步研究發現，槲皮素對SiHa/DDP細胞的逆轉耐藥倍數為4.00，表明槲皮素對順鉑耐藥細胞SiHa/DDP具有一定逆轉作用。這與杜春雙等[7]的研究結果相吻合。

p70S6K是mTOR蛋白的下游底物，被p-mTOR蛋白激活后可調控細胞內p70S6K mRNA的表達，從而影響乳腺癌等惡性腫瘤的發生、發展[22]。P-gp是一種腺嘌呤核苷三磷酸依賴性跨膜轉運蛋白，人體中P-gp越多則癌細胞產生耐藥性的能力就越強，因此抑制P-gp蛋白的表達和功能是逆轉多藥耐藥的重要途徑[23]。其次，有研究表示，mTOR是PI3K/Akt/mTOR信號通路的下游成分之一，其抑制劑雷帕霉素可通過抑制該信號通路活性降低宮頸癌細胞的遷移與侵襲[24]。因此，本研究采用雷帕霉素作為本實驗的抑制劑。本研究結果顯示，經槲皮素聯合順鉑處理后，SiHa/DDP細胞中的Akt、mTOR、p70S6K的蛋白磷酸化水平和P-gp蛋白表達水平均顯著降低，這與槲皮素聯合抑制劑雷帕霉素處理后的結果一致，進一步表明槲皮素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，逆轉SiHa/DDP細胞的耐藥性。

綜上所述，槲皮素可逆轉SiHa/DDP細胞對順鉑的耐藥性，其作用機制與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達有關。

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（收稿日期：2021-05-18 修回日期：2021-10-25 ）

（編輯：唐曉蓮）