基于網絡藥理學探討新冠肺炎初期用藥清肺排毒湯的作用機制

任星 楊靜 張菀桐 高蕊

摘要 目的：利用網絡藥理學方法研究清肺排毒湯（QFPDT）治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的物質基礎和作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫，GeneCards數據庫獲得藥物有效成分、靶點蛋白及相關疾病，運用Uniprot數據庫查詢靶點蛋白對應的基因名稱。借助Cytoscape 3.7.2軟件構建藥物活性成分-潛在靶點，主要作用靶點-相關疾病的網絡模型;運用Cytoscape 3.7.2軟件中的ClueGo插件對主要潛在靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：經篩選得到278個化合物，177個QFPDT調控的靶點蛋白。根據度（Degree）值得到QFPDT主要有效成分為槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇和山柰酚。相關疾病較多的靶點為PTGS2、PPARG、MAPK14和CDK2，與COVID-19相關的疾病包括炎癥、哮喘、肺癌、發熱、病毒感染等。QFPDT作用的主要通路為IL-17信號通路，雌激素信號通路，血小板活化通路及小細胞肺癌等通路。結論：對QFPDT的物質基礎和作用機制進行了初步預測，為QFPDT在COVID-19的臨床治療中提供了依據。

關鍵詞 清肺排毒湯;網絡藥理學;新型冠狀病毒肺炎;物質基礎;作用機制

Abstract Objective：To explore the material basis and action mechanism of Qingfei Paidu Decoction（QFPDT） and coronavirus disease（COVID-19） by using network pharmacology.Methods：The active ingredients，target proteins and related diseases were obtained through TCMSP Database.Uniprot database was used to query the gene names corresponding to the target proteins.Cytoscape 3.7.2 software was used to build a network model of drug active ingredients-potential targets and main targets-related diseases; ClueGo plugin of Cytoscape 3.7.2 software was used to perform GO biological processes on main potential targets and KEGG metabolic pathway analysis.Results：After screening，278 compounds and 177 target proteins regulated by QFPDT were obtained.According to the degree value，the main active ingredients of QFPDT were quercetin，stigmasterol，β-sitosterol and kaempferol.The targets of related diseases were PTGS2，PPARG，MAPK14，and CDK2.The diseases related to COVID-19 pneumonia included inflammation，asthma，lung cancer，fever，and viral infection etc.According to the analysis of GO biological processes and KEGG metabolic pathways，the main pathways of QFPDT action were IL-17 signaling pathway，estrogen signaling pathway，platelet activation pathway，and small cell lung cancer.Conclusion：This paper makes a preliminary prediction of the material basis and mechanism of QFPDT，and provided a basis for QFPDT in the clinical treatment of COVID-19.

Keywords Qingfei Paidu Decoction; Network pharmacology; COVID-19; Material basis; Action mechanism

中圖分類號：R289.5;R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.007

新型冠狀病毒（2019-nCoV）引起的肺炎自2019年12月出現后迅速蔓延全國，其具有潛伏期長、傳染性強、各類人群普遍易感的特點。隨著疾病在全國的蔓延，人們的日常生活及工作受到了一定的影響，同時對人民健康帶來的威脅，引起了國家的高度重視。2020年2月12日，世界衛生組織宣布，將2019-nCoV引發的疾病正式命名為COVID-19，即Corona Virus Disease 2019，目前國家衛生健康委員會將其暫命名為新型冠狀病毒肺炎，即新冠肺炎[1]。初期感染新冠肺炎患者臨床癥狀多見發熱、干咳、乏力，后期重癥患者可見呼吸困難甚至嚴重性呼吸衰竭[2]。新冠肺炎尚無特效藥，且發病機制不明確，目前以中西醫結合對癥治療為主。湖北省一半以上的確診病例都使用中醫藥治療并取得一定成效[3]，體現了中醫藥治療在此次抗擊新冠肺炎中的優勢。

中醫強調整體觀念和辨證論治，國家大力發揮中醫藥的優勢特色，國家中醫藥管理局推薦在中西醫結合救治中使用清肺排毒湯（QFPDT）[4]。QFPDT是由《傷寒雜病論》中多個經方融合創新而成，以麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯、五苓散、橘枳姜湯加減化裁，共21味藥物組成[5]。該復方在山西、河北、黑龍江、陜西4省試點期間初步有效率達到90%以上，取得了較為理想的療效，對當前中醫藥治療新冠肺炎起到了積極的指導作用。

網絡藥理學作為研究中藥單體及復方的作用及作用機制的新興學科，通過對藥物成分、作用靶點及對應疾病等信息進行數據整合及建模的方式進行分析[6-7]。本研究旨在基于網絡藥理學的方法篩選出QFPDT中藥物成分及作用的靶點，預測與QFPDT主要作用靶點相關的疾病，構建靶點網絡，并進行富集分析。初步探索QFPDT治療COVID-19的物質基礎及作用機制。

1 材料與方法

1.1 獲取QFPDT候選靶點 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），搜索并獲取QFPDT的藥物（除石膏外）化學成分，根據口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18進一步篩選QFPDT的有效化合物。根據藥物已知成分，在TCMSP數據庫及GeneCards數據庫獲取成分作用靶點，將獲取的靶點進行去重處理，排除重復靶點。運用Uniprot數據庫查詢靶點蛋白對應的基因簡稱，得到QFPDT調控的潛在靶點。

1.2 QFPDT藥物成分-候選靶點網絡的構建 應用Cytoscape 3.7.2軟件構建QFPDT藥物成分-候選靶點網絡圖。通過對候選靶點度（Degree）值分析，獲得大于平均Degree值的靶點。

1.3 QFPDT主要作用靶點-相關疾病網絡的構建 應用TCMSP數據庫，篩選獲得上述大于平均Degree值的靶點的相關疾病。運用Cytoscape 3.7.2軟件構建QFPDT主要作用靶點-相關疾病網絡圖。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 將QFPDT中主要靶標基因，即上述獲得的大于平均Degree值的靶點導入Cytoscape3.7.2軟件的ClueGO插件中進行GO生物過程及KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 QFPDT藥物化學成分篩選 篩選共得到310個有效活性成分，部分篩選結果見表1。

2.2 QFPDT藥物候選靶點篩選 將上述獲得的310個QFPDT活性成分引入TCMSP數據庫及GeneCards數據庫，獲得278個活性成分對應182個疾病靶點（其中有32個活性成分的疾病靶點未被TCMSP數據庫及GeneCards數據庫收錄）。將上述獲得的QFPDT作用靶點輸入到Uniprot數據庫中查詢靶點蛋白對應的基因簡稱，剔除非人源靶點后最終得到QFPDT調控的疾病靶點177個。構建QFPDT藥物成分-候選靶點網絡。該網絡共包含455個節點，6 724條邊。其中278個粉色圓形節點代表QFPDT活性成分，177個藍色方形節點代表活性成分作用的疾病靶點，6 724條邊代表成分與靶點之間的相互作用關系。在網絡中，一個節點的度（Degree）表示網絡中和節點相連路線的條數。在化合物方面，越靠近中心形狀越大的節點表示該化合物的Degree值越高，與其對應的靶點越多，說明這些化合物可能是QFPDT中起主要作用的化合物。見圖1。

其中有4個化合物的Degree值≥300，分別是MOL000098槲皮素（Quercetin），MOL000449豆甾醇（Stigmasterol），MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol），MOL000422山柰酚（Kaempferol）。在化合物作用的疾病靶點方面，節點形狀越大表示該靶點的Degree值越高。177個靶點的平均Degree值為38，網絡圖中深藍色的節點共40個，為Degree≥38的靶點。見表2。

2.3 QFPDT主要作用靶點-相關疾病網絡模型的構建 將上述獲得的40個重要靶點分別引入TCMSP數據庫，獲取各靶點對應的相關疾病。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建QFPDT主要作用靶點-相關疾病網絡圖。該網絡包括187個節點（40個作用靶點和147個疾病）和228條邊。橘黃色節點表示QFPDT的主要作用靶點，藍色節點表示相關疾病。節點形狀越大，表示該節點的Degree值越高，即相關疾病越多。其中Degree值最大的靶點為PTGS2（Degree=32），與炎癥、炎癥性疾病、肺癌、發熱等疾病密切相關，其次是PPARG（Degree=21），與哮喘、炎癥、慢性炎癥性疾病等密切相關，MAPK14（Degree=13）與成人呼吸窘迫綜合征、炎癥相關，CDK2（Degree=13）與病毒感染有關，以上Degree值較高的靶點相關疾病的癥狀，均與新冠肺炎相關癥狀如發熱、咳嗽、呼吸困難相符，表明QFPDT作用的主要靶點可能在新冠肺炎治療中發揮重要作用，為進一步機制探索提供依據。見圖2。

2.4 GO生物過程及KEGG通路富集分析

將已獲得的40個QFPDT主要作用靶點導入Cytoscape3.7.2軟件的ClueGO插件中進行GO生物過程及KEGG通路富集分析，設置P≤0.05，得到QFPDT相關的GO生物過程及KEGG通路結果。

2.4.1 生物過程聚類分析結果 通過GO生物過程分析，獲得18個QFPDT相關生物過程，聚類至此生物功能的映射靶點越多，面積越大，得出QFPDT可能主要是參與影響氧化還原酶活性、類固醇激素受體活性、對感冒的反應調節、端粒酶活性的調節等體內生物過程。見圖3。

2.4.2 KEGG聚類分析結果 為進一步探究QFPDT的具體相關機制，開展KEGG通路探索，共獲得19個信號通路，其中可能與COVID-19相關的通路包括IL-17信號通路、雌激素信號通路、血小板活化通路和小細胞肺癌通路等。見圖4。

3 討論

本研究運用網絡藥理學手段，通過分析QFPDT分子網絡在生物功能方面的異同，初步探索QFPDT的物質基礎和可能作用機制。在化合物方面及作用靶點方面，共篩選出QFPDT 278個有效活性成分和177個作用靶點。作用最強的4個化合物分別是槲皮素（Quercertin），豆甾醇（Stigmasterol），β-谷固醇（Beta-sitosterol）和山柰酚（Kaempferol）。槲皮素是一種中草藥中提取的黃酮類化合物。已有研究揭示了它的抗炎、抗癌、抗氧化和抗凋亡活性[8]，能夠阻斷中東呼吸綜合征冠狀病毒3C-like蛋白酶的活性[9]。豆甾醇與β-谷固醇均屬于植物甾醇，是植物的一種活性成分。藥理研究表明豆甾醇可刺激網狀內皮系統增生，加強巨噬細胞的能力，從而發揮抗炎作用[10]。β-谷固醇作為麻黃、桂枝、紫菀和款冬花的化學成分，在抗病毒，抗炎，免疫調節等過程中也發揮重要的藥理作用[11]。萬星等[12]研究表明，β-谷固醇可通過抑制TNF-α、核因子κB等信號通改善肝纖維化損傷。山柰酚作為乙醇提取物的有效抗病毒成分，能顯著抑制M2病毒mRNA的合成和病毒蛋白M2的表達，從而發揮抗流感病毒的作用[13]。

QFPDT的21味藥物中同時含有槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇和山柰酚4個主要活性化合物的藥物為麻黃，其中同時含有槲皮素、豆甾醇和山柰酚的藥物為柴胡，同時含有槲皮素、β-谷固醇和山柰酚的藥物為款冬花和紫菀。由此可以推測，QFPDT中起主要作用的藥物可能為麻黃、柴胡、紫菀和款冬花。麻黃作為整個解表藥中最強的發汗藥，為治療外感風寒高熱、邪氣在表必不可少的藥物，現代藥理研究也表明，麻黃具有調節機體產熱與散熱比例，減少機體產熱增加散熱的功效[14]。《神農本草經》有云：“柴胡治……寒熱邪氣。”記載柴胡具有解熱的功效。王德山和馬吉慶[15]研究表明柴胡有明顯的鎮靜、鎮咳作用，其解熱作用可能與中樞抑制有關。紫菀和款冬花作為具有止咳平喘療效的藥對，在臨床上被廣泛應用。李聰等[16]研究發現紫菀、款冬花部位配伍后顯著提高抗炎效果，符合相須、相使配伍理論。麻黃、柴胡、紫菀和款冬花發揮較為關鍵的解表散熱，止咳平喘，鎮靜抗炎作用，與COVID-19表現出的發熱、咳嗽等主要癥狀非常吻合。

在QFPDT主要作用靶點-相關疾病分析中，與疾病關聯較多的靶點為環加氧酶2（PTGS2），過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）。相關研究證實，PTGS2在中藥介導的肺炎抑制中起關鍵作用[17]。PPARG可以介導免疫細胞（包括炎性巨噬細胞）的早期和持續的浸潤致使流感病毒的致病性增強[18]。MAPK14是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員在感染SARS-CoV時可檢測到所有3個MAPK成員的磷酸化[19]，也可能被其他人類冠狀病毒所激活[20]。流感病毒在感染期間通過觸發宿主抗病毒反應、阻斷宿主進程和抑制宿主mRNA處理改變宿主細胞蛋白質組，流感介導的宿主變化主要聚集在HLA-B、ACTB、HSP90AB1、CDK2和ANXA2周圍[21]。周期蛋白依賴性激酶（CDK）調控著細胞周期各個環節的起始與進程，進而控制細胞的增殖和凋亡[22]。其在病毒感染控制中起著非常重要的作用。通過QFPDT主要作用靶點-相關疾病網絡分析，PTGS2、PPARG、MAPK14和CDK2與炎癥、炎癥性疾病、哮喘、肺癌、發熱、病毒感染等疾病密切相關，與COVID-19相關癥狀如發熱、咳嗽、呼吸困難相符，表明QFPDT作用的主要靶點可能在新冠肺炎治療中發揮重要作用。

通過GO生物過程聚類分析和KEGG通路聚類分析，可得知QFPDT可能主要參與氧化還原酶活性，類固醇激素受體活性，對感冒的反應調節以及端粒酶活性的調節等生物過程。在信號通路的調控方面，QFPDT可能主要調控IL-17信號通路，雌激素信號通路，血小板活化通路及小細胞肺癌等通路，對COVID-19相關癥狀進行干預。IL-17通路可通過激活核因子κB和MAPK誘導下游基因發揮抗炎作用[23]。冠狀病毒感染機體后，COVID-19可誘導多種細胞因子和化學趨化因子產生失控過激的病理反應，即“細胞因子風暴”。“細胞因子風暴”是由細胞因子和化學趨化因子通過激活核因子κB信號通路而引發的過激、失控的免疫應答，是引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭的重要因素[24]。由此，本研究推斷IL-17信號通路對在QFPDT干預COVID-19過程中起著至關重要的作用。

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（2020-12-18收稿 責任編輯：張雄杰）