基于網絡藥理學及體外實驗探討桔梗皂苷D對肝癌細胞遷移侵襲的影響及相關機制

郭園園，張浩然,2，卓士鉉，楊萬斌，傅鶴群，李雅靜，張正光

（1.南京中醫藥大學醫學院·整合醫學學院，江蘇 南京 210023；2.南京醫科大學基礎醫學院，江蘇 南京 211166）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見消化道惡性腫瘤，死亡率很高。據報道[1]，全球每年因罹患肝癌而死亡的人數超過50 萬，其中我國作為肝癌大國，約占總數的50%。目前臨床上常使用放化療和手術切除法治療肝癌。由于肝癌發病具有一定隱匿性，一旦確診即為晚期，僅有20%的患者能夠接受手術治療[2]。此外，肝癌具有很強的轉移侵襲性，手術愈后不佳，而化學藥物治療往往存在療效不顯著以及毒副作用強等弊端[3]。因此，尋求一種天然、高效、安全的抗肝癌藥物，尤其是尋找能夠抑制腫瘤細胞轉移的藥物迫在眉睫。桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）作為臨床傳統中藥桔梗的藥效物質基礎之一，具有抗炎、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等多種藥理學功效[4-7]。已有研究表明[8-11]，PD 能夠有效抑制如膽囊癌細胞、口腔鱗狀細胞癌細胞、子宮內膜癌細胞、多發性骨髓瘤細胞等多種腫瘤細胞的遷移侵襲，而關于PD 抑制肝癌細胞遷移侵襲的相關機制尚未完全闡明。人肝母細胞瘤細胞系（human hepatocellular liver carcinoma，HepG2）是目前應用最廣泛的人源肝癌細胞系之一，常作為藥物研究的肝癌體外細胞模型。本研究通過網絡藥理學及體外實驗方法，初步探究了PD 抑制肝癌HepG2 細胞遷移及侵襲的潛在分子機制，以期為臨床應用PD 治療肝癌提供相關研究基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、實驗試劑與器材 人肝母細胞瘤（人肝癌）HepG2 細胞株（中國科學院上海生科院細胞資源中心）；DMEM、新生胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素鏈霉素雙抗（Penicillin-Streptomycin）、胰酶（含0.25%EDTA，酚紅）（美國Gibco 公司）；桔梗皂苷D 藥物粉末（上海源葉生物科技有限公司）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；細胞增殖-毒性檢測（CCK-8）試劑盒（biosharp 公司）；Transwell 小室、Matrigel 基質膠（美國Corning-Costar 公司）。

1.1.2 實驗儀器 酶標儀（Bio Tek Instruments Inc.）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；凝膠成像系統（Bio-Rad Laboratories 公司）；超凈臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）；高速冷凍離心機、低溫冰箱、電子分析天平、PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）；顯微鏡（Olympus Corporation）；細胞培養箱（上海寶賽生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物及疾病潛在靶標的預測 通過HERB 數據庫（http://herb.ac.cn/）和PharmMapper 數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）查詢PD 可能的匹配靶標，下載并整合相關靶標信息。通過GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/），以“liver cancer metastasis”（LCM）為關鍵詞，檢索肝癌轉移相關靶標信息。通過TBtools 軟件繪制韋恩圖，篩選出PD 與肝癌轉移的共同作用靶標。

1.2.2 構建疾病-藥物-靶標相關網絡及蛋白互作網絡 利用Cytoscape3.7.1 軟件建立疾病-藥物-靶標相關網絡，STRING 數據庫（https://string-db.org/）構建并分析蛋白質-蛋白質相互作用網絡。

1.2.3 GO 富集分析與KEGG 富集分析 將篩選出的共同作用靶標導入到Rstuio 軟件中，利用“cluster－Profiler”包進行GO 富集分析與KEGG 富集分析。其中GO 富集分析包括3 個部分，分別為生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）。以P＜0.05 對富集得到的主要BP、CC、MF 及KEGG 信號通路進行篩選并進行可視化分析。

1.2.4 PD 藥液配置 配置濃度為10 μmol/L 的PD母液。使用時，用含10%胎牛血清的完全培養基和PD 母液配置濃度梯度的溶液[0 μmol/L（對照組）、4、8 μmol/L（PD 給藥組）]，隨后進行相關實驗。

1.2.5 細胞培養與傳代 使用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 完全培養基復蘇HepG2 細胞，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養。待細胞生長至密度為85%左右進行傳代。進行生物學實驗的HepG2 細胞應均處于對數生長期。

1.2.6 細胞形態學觀察 待細胞貼壁生長至65%左右，棄去培養基，用1×PBS 清洗后加入含有不同濃度PD 的DMEM 完全培養基（0、1、2、4、8、16 μmol/L），待培養至24、48 h 時置于顯微鏡下觀察HepG2 細胞生長狀況與細胞形態。

1.2.7 CCK-8 法篩選合適的PD 給藥濃度 向96 孔板中加入100 μl 的細胞懸液，24 h 后細胞貼壁棄去原培養液，向每孔中加入含不同濃度PD 的完全培養基培養48 h，隨后加入CCK-8 液，于37 ℃孵育1 h，使用酶標儀檢測其在450 nm 處的OD 值，實驗至少重復3 次。

1.2.8 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 將細胞接種于96 孔的細胞培養板中，每孔加入100 μl 的細胞懸液，待培養至48 h 時棄去原培養液，加入含有CCK8液孵育1 h，使用酶標儀檢測其在450 nm 處的OD值，實驗至少重復3 次。

1.2.9 傷口愈合實驗 預處理細胞48 h 后，使用200 μl無菌槍頭在6 孔板中劃出直線，PBS 洗去多余的細胞碎片后，加入培養基繼續培養，分別于0、36 h 時拍照觀察，實驗至少重復3 次。

1.2.10 Transwell 遷移和侵襲實驗 在遷移實驗中，向Transwell 上室中加入100 μl 不含有血清的DMEM 培養基重懸細胞，下室加入含20%胎牛血清的DMEM 培養基500 μl，分別于6、12、24 h 取出小室，PBS 洗滌3 次，用棉簽擦去微孔濾膜上室殘留細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色20 min，PBS 洗滌后風干。將小室置于載玻片上用顯微鏡觀察穿過濾膜的細胞并計數。每組以5 個視野的細胞進行計數，實驗至少重復3 次。侵襲實驗與遷移實驗操作步驟基本相同，區別在于在小室上室中鋪上了稀釋后的基質膠（以無血清DMEM 培養液稀釋8 倍）。

1.2.11 Western Blot（WB）實驗 將細胞接種至6 孔板中，將細胞預處理48 h 后，棄去培養液。用PBS 清洗后，于每孔中加入的適量RIPA 裂解液（強），用細胞刮收集細胞裂解液，置于1.5 ml 離心管中，反復吹打。使用4 ℃高速冷凍離心機，以12 000 g 離心15 min。使用BCA 法測定并統一蛋白濃度。上樣后，通過SDS-PAGE 電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉、孵育一抗、孵育二抗、曝光等步驟檢測相關蛋白表達水平。

1.3 統計學方法 使用Image J 對圖像數據進行比對分析，使用GraphPad Prism9 進行實驗數據的統計分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學預測PD 及肝癌轉移的共同作用靶標 通過HERB 數據庫及PharmMapper 數據庫查詢PD 可能的匹配靶標（Norm Fit＞0.7），下載并整合相關靶標信息，共得到PD 可能的靶標共47 個。通過GeneCards 數據庫收集肝癌轉移相關靶標8973 個，見圖1。通過TBtools 軟件繪制韋恩圖，篩選出PD與肝癌轉移的共同作用靶標有43 個，分別為CASP3、CASP8、EGFR、ESR1、GATA3、IFNG、IL2、IL4、IL10、MMP9、NOS2、RELA、TNF、IKBKG、CA2、HCK、F2、BCHE、PIM1、CDK2、TTR、CFB、MAPK10、CA1、TREM1、CDK5R1、MAPK8、NR1H2、GSR、AURKA、AR、HSPA8、ANG、ESR2、CDK6、PDPK1、PGR、SRC、NQO1、HSD17B1、AKR1B1、MTAP、SHBG。使用Cytoscape 軟件建立疾病-藥物-靶標相關網絡，見圖2。

圖1 PD 與肝癌轉移共同作用靶標的韋恩圖

圖2 Cytoscape 軟件建立疾病-藥物-靶標相關網絡

2.2 蛋白互作網絡分析 將43 個共同作用靶標輸入到STRING 網站，構建PD 抗肝癌轉移的蛋白互作網絡圖，通過Cytoscape 軟件中CytoHubba 插件的MCC 算法篩選出排名前10 的核心靶標，分別為CASP3、SRC、RELA、TNF、MMP9、EGFR、IL10、IL4、CASP8、MAPK8,見圖3。

圖3 PD 抗肝癌轉移蛋白互作網絡及核心靶標篩選

2.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析顯示，PD抗肝癌轉移涉及到1476 個相關生物學過程，包括調節炎癥反應（regulation of inflammatory response，GO:0050727）、細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress，GO:0062197）、外部凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway，GO:0097191）、細胞內受體信號通路（intracellular receptor signaling pathway，GO:0030522）等；涉及到9 個細胞組分，包括焦點粘附（focal adhesion，GO:0005925）、細胞-底物連接（cell-substrate junction，GO:0030055）、膜筏（membrane raft，GO:0045121）、膜微結構域（membrane microdomain，GO:0098857）、膜區域（membrane region，GO:0098589）等；涉及到76 個分子功能，包括細胞因子受體結合（cytokine receptor binding，GO:0005126）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity，GO:0004674）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding，GO:0031625）等，見圖4。KEGG 富集分析顯示，PD 抗肝癌轉移涉及到的相關信號通路包括白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway，hsa04657）、T 細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway，hsa04660）、C型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway，hsa04625）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway，hsa04668）等，見圖5。

圖4 PD 抗肝癌轉移的GO 富集分析

圖5 PD 抗肝癌轉移的KEGG 富集分析

2.4 PD 對HepG2 細胞形態的影響 對照組（0 μmol/L）的HepG2 細胞生長狀況良好，而給藥組HepG2 細胞形態均發生了不同程度的改變，包括皺縮、細胞內出現空泡、凋亡等現象。隨著PD 濃度的升高，HepG2 細胞形態變化愈發顯著，見圖6。

圖6 顯微鏡下不同PD 濃度預處理24 h 的HepG2 細胞形態圖

2.5 PD 最適給藥濃度分析 CCK-8 實驗顯示，當藥物濃度為0.5～4 μmol/L 時，其在450 nm 處吸光度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而當藥物濃度為≥8 μmol/L 時，其在450 nm 處吸光度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即PD 的最適給藥濃度為8 μmol/L，見圖7。

圖7 PD 最適給藥濃度分析

2.6 PD 對HepG2 細胞增殖能力的影響 與對照組相比，當PD 的濃度達到4 μmol/L 與8 μmol/L 時，細胞的增殖能力均受到抑制，并呈劑量依賴性降低，見圖8。

圖8 不同PD 給藥濃度處理的HepG2 細胞活性變化圖

2.7 PD 對HepG2 細胞遷移侵襲能力的影響 對照組HepG2 細胞的劃痕愈合率為（70.32±0.49）%；PD給藥組4 μmol/L 的劃痕愈合率為（33.764±2.54）%；8 μmol/L 的劃痕愈合率為（20.25±2.01）%，組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖9。為了進一步證實PD 對于HepG2 細胞遷移侵襲能力的抑制作用，Transwell 遷移實驗結果顯示，PD 給藥后HepG2 細胞遷移能力受到明顯的抑制，結果與傷口愈合實驗吻合，見圖10；侵襲實驗結果顯示，PD 給藥后HepG2 細胞的侵襲能力亦受到明顯抑制，結果與遷移實驗相同，見圖11。

圖9 不同濃度PD 預處理的HepG2 細胞0、36 h 的劃痕圖（200×）及愈合率定量圖

圖10 Transwell 遷移實驗結果

圖11 Transwell 侵襲實驗結果

2.8 E-cadherin 蛋白表達水平分析 WB 實驗顯示，與對照組相比，PD 給藥組E-cadherin 表達量升高，見圖12。

圖12 PD 抑制轉移與粘附標志物蛋白E-cadherin 的表達水平

3 討論

肝癌作為一種極常見的消化道惡性腫瘤，具有臨床治愈率低、易復發轉移、預后不良等特點，已成為致死率極高的癌癥之一，對人類生命健康造成了極大威脅[12-14]。現今多項研究證實[15-18]，中醫藥在包括肝癌在內的多種癌癥的治療中療效確切，具有廣闊的發展前景。相比西醫的手術、放化療等常規治療方法，中醫藥療法已有效應用于腫瘤治療的各個領域，其中中藥復方及其單體具有低毒、高效、安全等特點，已在癌癥臨床治療中被廣泛使用，如參芪扶正注射液、消癌平注射液、欖香烯注射液等，在臨床惡性腫瘤的治療中扮演著重要角色，亦可與西醫常規抗癌手段相結合，體現中西醫結合治療腫瘤的特色。

傳統中草藥桔梗作為中醫臨床傳統用藥，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿等功效，常被用于肺部相關疾病的治療，而桔梗的主要藥效成分之一——PD，其近年來已成為研究熱點。目前，PD 的抗癌作用已在多項研究中得到確證，其生物學過程涉及抑制腫瘤細胞增殖、抗血管生成、誘導自噬性死亡、促進細胞凋亡等多個方面[19-22]。同時，PD 已經被證實能夠有效抑制多種腫瘤細胞的遷移與侵襲行為，但PD 抑制肝癌細胞的遷移侵襲的機制尚未完全闡明。本研究以此為切入點，從網絡藥理學及體外實驗出發，探究了PD 抑制肝癌細胞遷移侵襲的潛在分子機制，以期為臨床利用PD 治療肝癌提供相關理論與實驗支撐。本實驗先從網絡藥理學出發，初步探討了PD抗肝癌轉移可能的分子機制，其中韋恩圖顯示PD與肝癌轉移共有14 個共同靶標；GO 富集分析表明，相關靶標的生物學過程涉及到調節炎癥反應及正性調控細胞間粘附等關鍵途徑；KEGG 通路分析顯示，PD 抗肝癌轉移可能與包括白介素-17 信號通路、T 細胞受體信號通路等密切相關。體外實驗則以人肝母細胞瘤HepG2 細胞株作為研究對象，首先通過對細胞進行形態學觀察，發現與對照組相比，PD給藥組中細胞皺縮變圓、出現空泡，死亡細胞明顯增多；隨后通過CCK-8 實驗、傷口愈合實驗、Transwell實驗進一步確證PD 能夠抑制肝癌HepG2 細胞增殖、遷移及侵襲行為；且WB 實驗結果顯示，PD 可能是通過上調細胞粘附的關鍵標志物E-cadherin 蛋白的表達，正性調控細胞粘附的生物學過程，從而抑制肝癌細胞的遷移侵襲能力。

本研究尚存在一定不足，今后將對相關靶標及信號通路進行進一步驗證，以深入探索PD 抗肝癌轉移的分子機制，同時亦會開展體內相關研究，為將來臨床有效利用PD 治療肝癌轉移提供參考。