雙室微生物燃料電池對土壤中鉛的去除研究

陸洪省，吳玉斌，張 瑤

(山東科技大學安全與環境工程學院，山東 青島 266590)

傳統的雙室微生物燃料電池（Microbial fuel cell，即MFC）是由陽極室與陰極室組成，中間由質子交換膜隔開[1]，由于使用質子交換膜導致成本昂貴，通常膜（如使用Nafion117膜）的成本占全部費用的50%[2]以上，所以，本研究是以鹽橋為質子交換通道，節省了大量成本。

產電細菌的種類很多，包括變形桿菌Proteobacteria、厚壁菌Firmicutes、土桿菌Geobacteraceae、擬桿菌Bacteriodetes及放線菌Actinobacteria[3]等。在多種細菌存在的條件下，研究MFC電子傳遞非常復雜，因此，考察單一產電細菌的電子傳遞機理，就成為提高MFC產電性能的重要途徑之一。

目前，全世界平均每年排放約500萬t鉛，其中大部分會進入土壤[4]。在我國320個重金屬重點污染區中，鉛是最嚴重的污染元素之一[5]。現階段，對于重金屬鉛污染的土壤進行治理的方法有物理化學法和生物修復法，其中，物理化學法對土壤攪動大，費用高，而生物修復法見效慢，且極易受土壤理化性質以及氣候環境條件的影響，所以，利用微生物燃料電池（MFC）方法富集或去除土壤中重金屬鉛的報道非常少！

本研究首先從活性污泥中分離產電細菌，將此單一產電細菌在陽極室中培養，而陰極室中填充土壤，利用土壤雙室MFCs裝置進行研究以下研究：在土壤中添加葡萄糖對MFC產電性能的影響；陰極室土壤中Pb2+在MFC條件下的遷移規律；產電細菌的生理生化性質以及分類學位置，以此為利用土壤MFCs富集土壤中的重金屬同時產生電能提供理論依據。

1 實驗

1.1 MFC實驗裝置

采用雙室MFC，實驗裝置如（圖1）所示。中間為陽極室，兩邊為兩個陰極室，陰極室暫命名為1號和2號陰極室。陽極室尺寸30 cm×30 cm×20 cm（長×寬×高），兩個陰極室尺寸相同，均為20×20×15 cm（長×寬×高）。陽極石墨板尺寸為10 cm×10 cm×0.5 cm（長×寬×厚），面積為100 cm2；陰極石墨板的尺寸均為5.0 cm×4.5 cm×0.4 cm（長×寬×厚），板面面積為22.5 cm2，陽極室與陰極室（1號和2號）分別用鹽橋連接。分別在1號和2號陰極室中填充土壤，土壤取自山東科技大學校園內，土壤取來后應先進行風干、研碎和過篩（目）。

圖1 微生物燃料電池裝置示意圖

鹽橋制作過程：準確稱取4 g瓊脂加入到盛有200 ml蒸餾水的燒杯中，加熱使瓊脂完全溶解。再稱量60 g KCl加入到燒杯中，繼續加熱，使KCl完全溶解，趁熱將混合液注入到U型塑料管中，塑料管兩口朝上，直至溶液溢出管口[6]。

1.2 產電細菌的分離與純化

在陽極室中添加乙酸鈉液體培養基，用于培養產電細菌。培養基組成（g·L-1）為：乙酸鈉為0.8，NH4Cl為0.31，KCl為0.13，Na2HPO4·12H2O為3.75，NaH2PO4·H2O為4.9，1 000 mL去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調節pH值至7.2，其中，在配制固體培養基時加入20 g瓊脂，配制半固體培養基時加入4 g瓊脂，液體和固體培養基均在121 ℃滅菌20 min后使用。

產電細菌分離于活性污泥的方法：將10 mL活性污泥加入到盛有190 mL的乙酸鈉液體培養基的三角瓶中，恒溫振蕩（130 r/min，30 ℃）培養4 d，取15 μL培養液劃線培養到乙酸鈉固體培養基上，30 ℃靜置培養，待長出菌落后，挑選單菌落，并多次重復劃線，直至菌落形態等一致，將分離純化的菌株保存在半固體培養基中，待用。

1.3 MFC的運行及產電性能的計算

將分離純化到的菌株接種到陽極室中的乙酸鈉液體培養基中（培養基的組成同1.2），在30 ℃條件下培養8 d，細菌掛膜完成。然后利用鹽橋將陽極室分別與兩陰極室相連，最后連接數據采集系統，此時，MFCs開始運行。在陽極室中利用厭氧袋創造厭氧環境，陰極室中土壤定期進行補濕，將MFCs置于30 ℃恒溫培養箱中；電池性能數據用RDAM-4017模塊進行采集，電壓電流分析軟件用數控6.1，其中輸出電壓（U）每10 S采集一次數據；外接5位可變直流電阻箱（型號：TAS986）。其中，電流通過公式I=U/R計算得出，式中I 為電流，U為輸出電壓，R 為外回路電阻，內阻、電壓-電流密度（V-J）以及功率-電流密度（P-J）測定均參照文獻[7]中進行，陰極石墨板面積用來計算電流密度。

1.4 陰極室土壤中Pb2+濃度測定

在MFCs運行結束后，分別取距離陰極石墨板等距離處的土壤，如（圖2）所示，即1號陰極室1和4（0cm處），2和5（5 cm處），3和6（10 cm處）位置的土壤，2號陰極室7和10（0cm處），8和11（5 cm處），9和12（10 cm處）的土壤各50 g，分別溶入200 mL去離子水中，充分攪拌、靜置，測定上清液中Pb2+的濃度，以平均值作為最終土壤中Pb2+濃度。Pb2+濃度測定采用原子吸收分光光度計（型號：TAS986）法，具體測定方法應按照原子吸收分光光度計測定步驟進行。

圖2 陰極室土壤的采集（導線處即為陰極電極板所在處）

1.5 產電細菌生理生化性質的分析及DNA的提取、測序、系統分類學位置的確定

產電細菌生理生化性質測定按照《常見細菌系統鑒定手冊》方法進行。該方法是利用柱式細菌基因組抽提試劑盒（UNIQ-10）對產電細菌DNA進行提取，提取方法按試劑盒說明書進行。PCR擴增用引物為細菌16S rDNA通用引物，由上海生物工程公司對菌株16S rDNA進行測序，測得的16S rDNA序列通過DDBJ（DNA Data Bank of Japan）數據庫中的Blast進行相似性比對，再利用CustalX2.0和Mega5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件創建系統樹，創建方法為鄰接法（Neighbor-Joining）。

2 結果

2.1 MFC輸出電流密度和電壓的分布

當MFC運行0～10 d，在土壤中添加葡萄糖跟未添加葡糖糖的兩種條件下，電壓升高幅度很慢，且兩種處理條件下電壓值均低于10 mV，但運行10 d后，土壤在兩種處理條件下MFC產生的電壓均在迅速增大，且土壤中添加葡萄糖的MFC產生的電壓明顯要高于未添加葡萄糖土壤的MFC產生的電壓，在MFCs運行15 d之后，兩種處理條件下的電壓值變化幅度變小，此時土壤中添加葡萄糖的MFC產生的電壓遠遠高于土壤中未添加葡萄糖的MFC產生的電壓，如圖3所示。

圖3 土壤在兩種處理條件下MFCs的輸出電壓曲線

為了表征土壤在兩種處理條件下MFC的電化學性能，本研究采用電流密度（Current density）-電壓（Voltage）進行說明，如（圖4）所示。外加電阻變化范圍為200～900 000 Ω，從（圖4）中可以看出，當外電阻在5 000～900 000 Ω變化時，土壤中添加葡萄糖電池的電壓（1號陰極室）遠遠高于土壤中未添加葡萄糖電池的電壓（2號陰極室），且1號陰極室最大電壓是65.5 mV，2號陰極室最大電壓是24.8 mV；而當外電阻在200～5 000 Ω之間變化時，兩者（1號陰極室和2號陰極室）所產生的電壓非常接近。

圖4 電流密度和電壓關系

從電流密度-功率密度曲線（圖5）中可以看出，外電阻在200～900 000 Ω之間變化時，土壤中添加葡萄糖（1號陰極室）以及未添加葡萄糖（2號陰極室）的兩組MFC，其產生的功率密度非常接近，當外電阻為1 300 Ω時，土壤中添加葡萄糖的MFC產生的最大功率密度為91.95 W·m-2，當外電阻為1 400 Ω時，土壤中未添加葡萄糖的MFC產生的最大功率密度為87.5 W·m-2。

圖5 陰極室中土壤的不同處理對MFCs功率密度的影響

2.2 不同取樣點土壤中Pb2+的濃度測定結果

向陰極室土壤中分別噴灑濃度為16.74 g/L的硝酸鉛溶液900 mL，攪拌均勻后，測得Pb2+初始濃度為3.125 g/kg。當MFCs運行結束后，分別取距離石墨板0 cm、5 cm和10 cm處的土壤50 g，用200 ml去離子水浸泡12 h，在浸泡過程中不斷攪拌，使土壤中Pb2+溶出到去離子水中，靜置5 h，取上清液，利用原子吸收分光光度計測定浸出液中Pb2+的濃度，其測定過程按照原子吸收分光光度計說明書操作，在得到Pb2+測定標準曲線后，根據標準曲線計算出不同位置土壤中Pb2+濃度，其結果如（表1）所示。從（表1）中可以看出，在土壤中添加葡萄糖（1號陰極室）和未添加葡萄糖（2號陰極室）的MFCs中，距離電極板越近，土壤中Pb2+濃度越大。通過比較1號和2號陰極室土壤中Pb2+濃度發現，在距離電極板0 cm處，1號陰極室土壤中的Pb2+濃度（5.347 g/kg）遠高于2號陰極室土壤中Pb2+濃度（4.725 g/ kg），相反，在距離陰極石墨板5 cm和10 cm處土壤中，1號陰極室土壤中Pb2+濃度明顯低于2號陰極室土壤中的Pb2+濃度。

表1 距離陰極板不同距離土壤中Pb2+的濃度

2.3 產電細菌CD-3生理生化性質及分類學位置的分析

2.3.1 菌株CD-3的生理生化性質

按照《常見細菌系統鑒定手冊》中操作步驟，對菌株CD-3的生理生化性質進行測定。菌株CD-3為革蘭氏陰性細菌，短桿狀，氧化酶、過氧化氫酶反應為陽性，其能利用葡萄糖為碳源，但不能利用阿拉伯糖為碳源。

2.3.2 菌株CD-3的系統分類學位置

對菌株CD-3的16S rDNA序列進行PCR擴增，將擴增序列提交到DDBJ獲得收錄號LC012001。用CustalX2.1和Mega5軟件對菌株CD-3的16S rDNA序列以及同源性較高菌株的16S rDNA序列創建系統發育樹創建，如圖6所示。從圖6可以看出，菌株CD-3的16S rDNA序列與菌株Ochrobactrum ciceri（DQ647056）的同源性最高，達98%。因此，菌株CD-3應屬于蒼白桿菌屬，并命名為Ochrobactrum sp.CD-3（LC012001）。

圖6 緊鄰法構建的基于Ochrobactrum sp.CD-3及相關菌株16S rDNA序列的系統發育樹

3 討論

在土壤中添加葡萄糖跟未添加葡萄糖的兩種處理條件下，最大功率密度分別為91.95 mW·m-2和87.5 mW·m-2，對Pb2+遷移的影響前者明顯優于后者，且在靠近電極板的位置，添加葡萄糖土壤中的Pb2+濃度遠高于未添加葡萄糖土壤中的Pb2+濃度，在遠離電極板土壤中Pb2+濃度正好相反，添加葡萄糖土壤中Pb2+濃度遠低于未添加葡萄糖土壤中Pb2+濃度。利用最大功率密度求出的MFCs內阻來看，土壤中添加葡萄糖的MFC的內阻為1 300 Ω，未添加葡萄糖MFC的內阻為1 400 Ω。此根據來源于Quan et al.（2013）[8]，An et al.（2013）[9]和Ball（2007）[10]。

本研究中分離到的產電細菌Ochrobactrum sp.CD-3為革蘭氏陰性，能夠利用乙酸鈉、葡萄糖等為碳源，這與產電細菌Ochrobactrum anthropi相似。