針刺對超負荷運動致骨骼肌損傷大鼠氧化應激損傷、骨骼肌細胞凋亡及相關信號通路的影響*

王水元，楊立志，李 明，崔 浩，熊 毅，高 舉

（1.洪湖市人民醫院康復醫學科，洪湖 433200；2.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院康復醫學科，武漢 430000）

隨著人們對體育競技的重視，教練員和運動員常采用超負荷訓練以提高運動和競技能力。但超負荷運動后，骨骼肌纖維會出現運動性肌肉損傷，不僅會出現延遲性肌肉酸痛還會使運動能力下降，若不采取及時治療，將會加劇肌肉損傷，并造成慢性疼痛[1-2]。目前對于超負荷運動導致的骨骼肌損傷，主要依靠生化藥物來緩解治療，然而這些藥物在被人體吸收的同時會產生代謝廢物，有些代謝廢物會產生毒副作用[3]。因此，探索出促進骨骼肌損傷快速恢復的安全有效的方法是目前運動醫學界的當務之急。針灸是一種傳統的中醫治療方式，和藥物治療相比，具有其特有的優勢，且在肌肉勞損等病癥方面已取得不錯效果[4-5]。相關研究報道，針刺可以促進超負荷訓練后骨骼肌線粒體結構的恢復，從而改善超負荷訓練對骨骼肌的損傷程度[6]。孔梅等[7]研究報道，針刺干預可以有效增加肌膜下線粒體融合程度，減少胞膜窖數量，從而抑制超負荷運動引起的骨骼肌肌束膜銜接盤結構域的變化。劉曉然等[8]研究報道，針刺可以緩解骨骼肌微管的損傷，從而促進超負荷運動后骨骼肌的修復。但對于針刺在超負荷運動致骨骼肌損傷中是如何發揮修復作用的，其具體機制尚無定論。本研究旨在通過對大鼠進行超負荷訓練以構建超負荷運動致骨骼肌損傷大鼠模型，予以針刺干預，探討針刺對超負荷運動致大鼠骨骼肌損傷及相關信號通路的影響，以期為針刺在超負荷運動所致骨骼肌損傷的治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

清潔級健康雄性SD 大鼠（許可證號：SYXK 2019-0108）60 只，45～55 日齡，體重250～300 g，購自勁牌有限公司；本實驗經過動物倫理委員會批準同意且本動物實驗嚴格遵循動物實驗減少（Reduction）、優化（Refinement）和替代（Replacement）-3R原則。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號：RJ15503）購自上海仁捷生物有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（貨號：ml097316）、琥珀酸脫氫酶（succinic acid dehydrogenase，SDH）試劑盒（貨號：SDH）和超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號：ml077379）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（貨號：ml076592）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒（貨號：ml076416）均購自酶聯生物有限公司；RAPI蛋白裂解液（貨號：89900）購自北京雷根生物技術有限公司；PI3K抗體（貨號：sc-365290）、AKT 抗體（貨號：sc-5298）、HRP 標記的山羊抗兔二抗均購自圣克魯斯生物技術公司；山羊抗大鼠IgG 二抗購自Abbkine 公司；內參小鼠抗β-肌動蛋白抗體（β-actin，貨號：SY0632-QIK）購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海撫生實業有限公司。CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；MH-2 型微型振蕩儀購自北京銘成基業科技有限公司；SAF-680T酶標儀購自上海巴玖公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構建

將適應性喂養1 周后的60 只大鼠隨機分為5 組：健康對照組、超負荷組、針刺組、超負荷+針刺組，每組15只。健康對照組和針刺組不進行運動干預，超負荷組和超負荷+針刺組參照文獻[9]通過超負荷運動建立骨骼肌損傷模型，具體操作如下：在1 m3的池中注深度為70 cm 的水，并使水溫在33 ℃左右，第1 周每次先讓超負荷組、超負荷+針刺組的大鼠入水中適應水性1 h，然后讓大鼠負重其體質量5%的重物在水中訓練1 h；第2 周則每次直接讓大鼠負重其體質量8%的重物訓練2 h。每組隨機選取1 只大鼠檢測血清睪酮與皮質酮水平，與健康對照組比較，若血清睪酮與皮質酮的比值下降40%[10]及以上，則表示造模成功。針刺組和超負荷+針刺組大鼠根據《實用動物針灸手冊》的標準，參照文獻[11]每次在大鼠超負荷運動后針刺大鼠雙側足三里、陽陵泉、內關和腎俞穴，留針20 min。造模及針刺過程中，健康對照組無動物死亡，超負荷組死亡3 只，針刺組死亡1 只，超負荷+針刺組死亡2 只，剩余54只全部進行實驗。

1.2.2 血清CK和LDH活性檢測

針刺干預結束后，每組隨機選取6 只大鼠，經10%水合氯醛麻醉后，將大鼠斷頸處死，分別取血清和骨骼肌組織，骨骼肌組織放入超低溫冰箱中備用。血清于4 ℃下靜置0.5 h 后，進行離心操作（3 000 r/min，10 min），分離血清。然后，按照試劑盒操作指南，檢測大鼠血清中CK和LDH含量水平。

1.2.3 骨骼肌中氧化應激相關物質水平檢測

取冰箱備用的部分骨骼肌組織，經0.9%生理鹽水漂洗后，擦干稱重，置于小燒杯中。用移液管量取0.86%的預冷生理鹽水3 mL 和剪碎的組織倒入勻漿管中，充分研磨使組織勻漿化；然后轉移到離心管內進行離心操作（3 000 r/min，10 min），離心后取下層沉淀，通過超聲破碎儀將骨骼肌的線粒體破碎，加入2 mL裂解液，根據試劑盒說明操作，用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測各組大鼠骨骼肌組織勻漿中MAD、GSH-Px、SDH和SOD水平。

1.2.4 蘇木精—伊紅（HE）染色

針刺干預結束后，每組隨機選取3 只大鼠，經10%水合氯醛麻醉后，將大鼠斷頸處死，取部分骨骼肌組織，剩余骨骼肌組織放入超低溫冰箱中備用。將骨骼肌組織在4 ℃預冷的生理鹽水中清洗，在冰上將組織剪成小塊，置入濃度為10%的甲醛溶液中固定，待一天一夜后，置入乙醇脫水3 h；然后進行石蠟包埋、切片操作，放入60 ℃恒溫箱20 min，把烤干的玻片放置在染色架上，然后放進二甲苯與乙醇等比混合液中，浸泡12 min后再放入二甲苯浸泡20 min，乙醇中浸泡25 min，將二甲苯洗后，放蒸餾水中浸泡2 min，蘇木精中染色2 min，在小流量水下沖洗4 min，再放入伊紅溶液中浸泡20 s，置于60 ℃恒溫15 min，在乙醇中脫水6 min，二甲苯中浸泡20 min，然后通過樹膠封片，烘干后，在生物顯微鏡下觀片。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取HE 染色中部分剩余骨骼肌組織，將其剪碎約1 mm3大小，搓洗后收集細胞懸液，然后進行離心，除去上清，用70%乙醇固定，經PBS 洗滌后，加入100 μL二甲基亞砜、20 μLAnnexinV-FITC及20 μL PI，37 ℃避光反應20 min，在流式細胞儀中檢測細胞的凋亡率。

1.2.6 蛋白質印跡法

取HE 染色中剩余骨骼肌組織，在液氮中進行研磨，研磨后加入到RAPI裂解液中進行勻漿，然后進行離心操作（4 ℃，12 000 r/min），離心12 min，離心后EP管中液體分三層取上清液，通過蛋白質定量法測定蛋白含量后，進行SDS-PAGE電泳，通過半干法將分離的蛋白轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉在搖床中進行封閉（37 ℃，1 h），加入一抗（1∶1 000）（PI3K，AKT，Bcl-2和Bax抗體），β-actin（1∶1 000），4 ℃過夜，IgG二抗（1∶2 000），37 ℃下孵育1 h，顯色成像并通過Image-ProPlus軟件分析條帶灰度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺對大鼠血清指標的影響

與健康對照組比較，超負荷組大鼠血清CK 和LDH水平明顯升高（P＜0.05）；與超負荷組比較，針刺組和超負荷+針刺組血清CK和LDH水平明顯降低（P＜0.05）；與針刺組比較，超負荷+針刺組血清CK和LDH水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清CK和LDH水平比較，n=6

表1 各組大鼠血清CK和LDH水平比較，n=6

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

2.2 針刺對大鼠骼肌氧化應激水平的影響

與健康對照組比較，超負荷組大鼠MDA 水平明顯升高，SOD、GSH-Px 和SDH 和水平明顯降低（P＜0.05）；與超負荷組比較，針刺組和超負荷+針刺組MDA 水平明顯降低（P＜0.05），GSH-Px、SOD、SDH 水平顯著升高（P＜0.05）；與針刺組比較，超負荷+針刺組MDA 水平顯著升高，GSH-Px、SOD 和SDH水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌中SOD、GSH-Px和SDH水平比較，n=6

表2 各組大鼠骨骼肌中SOD、GSH-Px和SDH水平比較，n=6

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

2.3 HE染色觀察針刺對大鼠骨骼肌損傷病理形態學的影響

HE 染色結果顯示，健康對照組和針刺組大鼠的骨骼肌未見異常，肌纖維完整，細胞核大小形態均正常；超負荷組大鼠骨骼肌肌纖維不完整，肌纖維間細胞增生，細胞核固縮、溶解，可見炎性細胞浸潤，膠原纖維增生嚴重；超負荷運動+針刺組病理程度明顯減輕，只有少量炎性細胞浸潤，肌纖維間細胞增生也明顯變少。

2.4 針刺對大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響

健康對照組大鼠骨骼肌細胞凋亡率為（7.12±1.02）%、超負荷組為（28.64±2.31）%、針刺組為（9.03±1.25）%、超負荷+針刺組為（15.02±1.53）%（F=110.42，P＜0.001），與健康對照組比較，超負荷組大鼠骨骼肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；針刺組與健康對照組的骨骼肌細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與超負荷組比較，超負荷+針刺組大鼠骨骼肌細胞凋亡水平明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖1 HE染色觀察大鼠骨骼肌病理學變化（×400）

圖2 各組大鼠骨骼肌細胞凋亡染色圖

2.5 針刺對大鼠骨骼肌PI3K/AKT 信號通路的影響

與健康對照組比較，超負荷組PI3K、AKT 蛋白水平明顯下調（P＜0.05）；針刺組中PI3K、AKT蛋白水平與健康對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與超負荷組比較，超負荷+針刺組組大鼠骨骼肌PI3K、AKT 蛋白水平明顯上調（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 各組信號通路相關蛋白表達水平比較，n=3

表3 各組信號通路相關蛋白表達水平比較，n=3

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

圖3 針刺對PI3K/AKT信號通路相關蛋白的影響

2.6 針刺對大鼠骨骼肌凋亡蛋白表達的影響

與健康對照組比較，超負荷組Bcl-2 蛋白水平明顯下調，Bax蛋白水平明顯上調（均P＜0.05）。與超負荷組比較，超負荷+針刺組大鼠骨骼肌Bcl-2蛋白水平無顯著差異（P＞0.05），Bax蛋白水平明顯下調（均P＜0.05），見圖4、表4。

圖4 針刺對凋亡相關蛋白的影響

表4 各組凋亡相關蛋白表達水平比較，n=3

表4 各組凋亡相關蛋白表達水平比較，n=3

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

3 討論

針刺療法作為一種傳統的中醫療法，已經存在了數千年，且在骨骼肌損傷的治療中取得了顯著的效果[12]。有證據顯示，在機體特定穴位進行針刺，刺激信號將通過組織間機械力的傳導傳遞給周邊組織，引發級聯效應，最后致使細胞發生一系列功能性反應[13]。本研究為探索針刺對超負荷運動致骨骼肌損傷的作用及相關機制，通過將大鼠進行超負荷訓練制造骨骼肌損傷大鼠模型，然后針刺大鼠足三里、陽陵泉、內關和腎俞穴3 個穴位，檢測大鼠血清CK和LDH水平，觀察骨骼肌病理形態學改變，檢測與氧化應激損傷相關物質的含量、骨骼肌細胞凋亡情況以及相關通路蛋白的表達水平。中醫認為，針刺腎俞穴和足三里具有補腎益精、增加體能的功效[14]。現代醫學研究表明，針刺腎俞穴可以有效抑制氧化應激反應從而實現機體的正常生理反應和免疫反應；針刺陽陵泉穴和內關穴可以有效刺激機體的免疫系統，提升對炎癥的抵御力[15]。以上證據說明了刺激這3個穴位的合理性和科學性。

CK 和LDH 作為骨骼肌損傷的生物標志物，可以反映骨骼肌微細損傷的程度[16]。當超負荷運動致使骨骼肌細胞膜遭到破壞，此時CK 和LDH 就會從細胞內滲漏到血液中，導致血清中CK 和LDH 水平明顯升高。本實驗發現，大鼠超負荷運動后血清中CK 和LDH 水平明顯升高，而經針刺干預后，CK 和LDH水平明顯降低。此外，在HE染色實驗中，發現針刺后大鼠骨骼肌損傷程度明顯減輕。說明針刺可以有效減輕大鼠骨骼肌的損傷程度。

在進行超負荷運動后，氧化應激是導致骨骼肌細胞損傷的重要因素之一[17]。超負荷運動后，體內活性氧會增多，會使細胞膜得通透性變強，進而氧化應激相關酶就會從細胞里被釋放到細胞外[18]。MDA可以反映脂質過氧化程度。SOD可以反映自由基清除能力，有效清除活性氧。SDH是線粒體內膜的結合酶，為有氧呼吸提供電子，SDH活性越強，組織的氧利用能力就越強。GSH-Px可以清除由活性氧和脂質過氧化物，保護細胞膜結構和功能的完整性。本實驗結果顯示，針刺后MDA 水平顯著降低，而SOD、SDH和GSH-Px水平均顯著升高。說明針刺可以有抑制氧化應激反應，其原因可能是針刺關鍵穴位后使得大鼠SOD活性增強，增強清除自由基的能力，減輕脂質過氧化，最終有效抑制氧化應激反應，與Seo 等[19]報道的針刺可以有效減輕大鼠氧化應激反應的結論相一致。

細胞凋亡在骨骼肌損傷中發揮重要作用[20]。本研究結果發現，超負荷組骨骼肌細胞凋亡率較健康對照組明顯升高，而經針刺干預后，細胞凋亡率明顯下降，說明針刺可以有效降低大鼠骨骼肌細胞的凋亡。Bcl-2家族也參與控制細胞凋亡的發生，該家族調控細胞凋亡的主要蛋白包括Bcl-2 和Bax。當觀察到Bax 蛋白表達升高，而Bcl-2 蛋白表達降低時，則預示細胞也啟動了凋亡程序。本研究結果顯示，與超負荷組比較，超負荷+針刺組大鼠骨骼肌Bcl-2 蛋白水平無顯著差異，Bax 蛋白水平明顯下調。這可能是因為研究所納入樣本量太少差異比較不具備統計學意義，后續可加大樣本量進行研究，但Bcl-2 蛋白表達顯著降低仍可表明細胞已啟動凋亡程序。這一結果與趙曉琴等[21]報道的針刺可以緩解大鼠離心運動后骨骼肌細胞凋亡的結論相類似。而PI3K/AKT信號通路在調控細胞的凋亡中起著關鍵作用。本實驗結果顯示，大鼠超負荷運動后PI3K 和AKT 蛋白水平顯著下降，而經針刺干預后，PI3K和AKT蛋白水平明顯回升，提示針刺大鼠足三里、腎俞穴等關鍵穴位后，PI3K/AKT信號通路被激活，從而抑制了骨骼肌細胞的凋亡。這一結果與既往研究報道的針刺大鼠足三里等穴位會激活AKT信號通路，抑制骨骼肌細胞凋亡[22]的結論相類似。

綜上所述，針刺可以緩解大鼠骨骼肌的損傷程度，其機制可能是針刺關鍵穴位后，PI3K/AKT信號通路被激活，從而抑制了骨骼肌細胞的凋亡，同時減輕了大鼠體內的氧化應激反應。