納洛酮對過氧化氫誘導的海馬神經元JNK/p38MAPK通路及凋亡的影響

郭志強，李鈺艷，許斌兵△

（四川省遂寧市中心醫院 1.麻醉科 2.內分泌科，遂寧 629000）

氧化應激是一種體內抗氧化與氧化作用失調的狀態，其所致的神經元凋亡是阿爾茨海默癥和帕金森病等中樞神經系統疾病發病的重要機制[1-2]。納洛酮（naloxone，NA）是一種人工合成的阿片受體拮抗劑，在臨床用于麻醉鎮痛過量挽救和急性呼吸抑制、急性酒精中毒等的治療[3-4]。既往研究表明，NA可通過抑制或阻斷病理損傷的最后途徑發揮神經保護作用[5]，但其是否通過抗氧化應激損傷減輕神經元凋亡而發揮神經保護作用并不清楚。過氧化氫（H2O2）是一種強氧化劑，常被用作構建氧化應激損傷模型的誘導劑[6-8]。本研究以小鼠海馬神經元為研究對象，旨在探討NA 對H2O2誘導的海馬神經元的保護作用機制是否與其抑制氧化應激所介導的細胞凋亡有關。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠海馬神經元HT22購于上海賽百慷生物技術股份有限公司，貨號：MNCL-010；NA購于上海熹垣生物，貨號：XY-USP-1 453005；H2O2購于上海聯碩生物科技有限公司，貨號：H1009；DMEM 培養基、放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于上海生工生物工程有限公司，貨號：E600010-0500、C500005、D110016-0100、D751027-0048，胎牛血清、細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、十二烷基硫酸—鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)試劑盒和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)活性檢測試劑盒購于上海索萊寶生物公司，貨 號：F8245-100、ck04、QS1500、CA1020、QS1001、P1320、K106-100；c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化(phospho，p)-JNK抗體購于美國Cell Signaling Technology，貨號：9252S、9255S；p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK) 和 pp38MAPK 抗體購于英國Abcam，貨號：ab31828、ab178867。

1.2 神經元培養 采用含10%胎牛血清的DMEM培養基在濕度為80%、溫度為37 ℃、二氧化碳體積分數為5%的細胞培養箱內常規培養小鼠海馬神經元HT22細胞，待細胞密度達80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗選取長勢良好的第3～5代指數期細胞進行實驗。

1.3 CCK-8法檢測神經元活力（1）H2O2最佳誘導濃度的選取：實驗分為①對照（0 μmol/L）組：正常培養HT22細胞；②空白組：不接種HT22細胞，只加入等量培養基；③5 個H2O2處理組：加入終濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 和400 μmol/L H2O2處理24 h；其中每組設3 個復孔。（2）NA 最佳作用濃度的選取：實驗分為①對照（0 μmol/L）組：同（1）；②空白組：同（1）；③5個NA處理組：加入終濃度為0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 和100 μmol/L NA 處理24 h；其中每組設3 個復孔。（3）NA 對H2O2誘導的細胞活力檢測：實驗分為①正常組：正常培養HT22 細胞；②空白組：同（1）；③H2O2組：以200 μmol/L H2O2處理24 h；④H2O2+低、高NA 2 個處理組：以200 μmol/L H2O2和0.1 μmol/L、1 μmol/L NA 共同處理24 h；其中每組設3 個復孔。將指數期HT22 細胞接種至96 孔細胞板上，于細胞培養箱內常規培養；根據上述分組對HT22 細胞處理結束后，棄培養液，加入CCK-8 工作液10 μL；室溫孵育2 h 后，采用酶標儀在490 nm 波長處檢測HT22 細胞光密度（optic density，OD）值，并以（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%表示神經元活力。實驗重復3次。

1.4 神經元上清液中LDH釋放量和SOD、MDA水平檢測 按照“1.3項”中實驗（3）處理HT22細胞后，收集正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA 組細胞上清液，參照LDH試劑盒和SOD、MDA試劑盒說明書檢測各組神經元上清液中LDH 釋放量和SOD、MDA水平。實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測神經元凋亡 收集處理結束后的正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA組細胞，使用磷酸緩沖液對細胞進行漂洗；300 μL 1×binding buffer調整細胞濃度后，取含有105個細胞懸液于上樣管中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI；避光雙染15 min后，上機檢測各組神經元凋亡情況。實驗重復3次。

1.6 神經元Caspase-3活性檢測 處理結束后的正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA 組細胞，以1 000 r/min離心15 min后，吸去上清液；經磷酸緩沖液洗滌后，加入細胞裂解液30 μL裂解10 min后，再次離心棄上清；嚴格參照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書檢測各組神經元Caspase-3活性。實驗重復3次。

1.7 免疫印跡法檢測神經元中JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 蛋白表達 收集處理結束后的正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA組細胞，加入RIPA裂解液抽提細胞總蛋白；采用考馬斯亮藍法檢測總蛋白濃度與純度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液充分混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min；將變性后的蛋白樣品行SDS-PAGE 分離后，濕轉法轉膜；采用含5%脫脂奶粉封閉液封閉聚偏氟乙烯膜2 h 后，以1∶2 000 比例稀釋的GAPDH、JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 一抗于4 ℃冰箱孵育過夜；次日，以1∶5 000 比例稀釋的GAPDH、JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 二抗室溫孵育2 h 后，滴加化學發光劑暗室內顯影曝光；以GAPDH 為內參，采用凝膠成像分析系統掃描分析神經元中JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS 24.0 進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2最佳誘導濃度的選取25 μmol/L、50 μmol/L H2O2作用后神經元活力雖有所降低，但與0 μmol/L 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而100 μmol/L、200 μmol/L 和400 μmol/L H2O2作用后神經元活力較0 μmol/L 明顯降低（均P＜0.05），且200 μmol/L H2O2作用后神經元活力為62.65%，故后續以200 μmol/L H2O2進行實驗，見表1。

表1 不同濃度H2O2作用后神經元活力變化n=9，

表1 不同濃度H2O2作用后神經元活力變化n=9，

與0 μmol/L比較，*P＜0.05。

2.2 NA 最佳作用濃度的選取 與0 μmol/L 比較，0.1 μmol/L 和1 μmol/L NA 作用下神經元活力明顯增強（均P＜0.05）；而10 μmol/L 和100 μmol/L NA作用后神經元活力較0 μmol/L 明顯降低（均P＜0.05），對神經元產生明顯毒性作用。故后續以0.1 μmol/L和1 μmol/L NA進行實驗，見表2。

表2 不同濃度NA作用后神經元活力變化n=9，

表2 不同濃度NA作用后神經元活力變化n=9，

與0 μmol/L比較，*P＜0.05。

2.3 NA 對H2O2誘導的海馬神經元活力及LDH 釋放量的影響 與正常組比較，H2O2組神經元活力明顯降低，而LDH釋放量明顯升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，H2O2+低NA 組和H2O2+高NA 組神經元活力明顯升高，而LDH釋放量明顯降低（均P＜0.05）；與H2O2+低NA 組比較，H2O2+高NA 組神經元活力明顯升高，而LDH釋放量明顯降低（均P＜0.05），見表3。

表3 各組神經元活力和LDH釋放量比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

2.4 NA對H2O2誘導的海馬神經元MDA和SOD水平的影響 與正常組比較，H2O2組神經元上清液中MDA 水平明顯升高，而SOD 水平明顯降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，H2O2+低NA組和H2O2+高NA組細胞上清液中MDA 水平明顯降低，而SOD 水平明顯升高（P＜0.05）；與H2O2+低NA 組比較，H2O2+高NA組細胞上清液中MDA水平明顯降低，而SOD水平明顯升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組神經元上清液中MDA和SOD水平比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

2.5 NA對H2O2誘導的海馬神經元凋亡的影響

與正常組比較，H2O2組細胞凋亡率和Caspase-3活性明顯升高（P＜0.05）；而H2O2+低NA組和H2O2+高NA 組細胞凋亡率和Caspase-3 活性較H2O2組明顯降低（P＜0.05）；H2O2+高NA組凋亡率和Caspase-3 活性較H2O2+低NA 組明顯降低（P＜0.05），見圖1和表5。

表5 各組神經元凋亡率和Caspase-3活性比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

2.6 NA 對H2O2誘導的海馬神經元JNK/p38MAPK通路的影響 與正常組比較，H2O2組神經元中JNK/p38MAPK 通路關鍵因子JNK 和p38MAPK 磷酸化水平明顯升高（P＜0.05）；而H2O2+低NA組和H2O2+高NA 組細胞中JNK 和p38MAPK 磷酸化水平較H2O2組明顯降低（P＜0.05）；H2O2+高NA 組細胞中JNK和p38MAPK磷酸化水平較H2O2+低NA組明顯降低（P＜0.05），見圖2和表6。

表6 各組中JNK和p38MAPK磷酸化水平比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

3 討論

大腦是神經系統最高級部分，相對其他組織而言，腦組織耗氧量多、能量代謝旺盛、抗氧化能力差，更易因氧自由基攻擊而發生氧化應激損傷；大量氧自由基的產生不僅可引起神經細胞蛋白質、核酸和脂質等功能的改變，還可激活凋亡執行因子Caspase-3 活化；而Caspase-3 活化后可引起一系列的酶級聯反應，促進神經細胞凋亡[9]。海馬是大腦邊緣系統的一部分，在記憶和空間定位等過程中發揮著重要作用；在阿爾茨海默病和帕金森等神經退行性疾病中海馬組織中伴隨著大量海馬神經元凋亡[2,10-11]，因此，抗海馬神經元凋亡是治療神經退行性疾病的重要策略。

作為一種強氧化劑，H2O2極易進入細胞產生氧自由基或羥基自由基，促進活性氧的產生，進而引起氧化應激損傷。LDH是一種糖酵解酶，在細胞受損時可從細胞內釋放到細胞外，常被作為反映細胞損傷的重要指標[12-13]。SOD是生物體內一種重要的抗氧化酶，可通過病理歧化作用清除過多的氧自由基，減輕細胞損傷；MDA是一種生物體脂質氧化產物，可導致細胞功能損傷；SOD和MDA常被作為反映細胞氧化應激損傷的重要指標[14]。本研究以不同濃度的H2O2誘導小鼠海馬神經元發現，200 μmol/L H2O2作用后神經元活力為62.65%，死亡較少；此外，200 μmol/L H2O2還可誘導神經元LDH釋放量、MDA水平、神經元凋亡率和Caspase-3活性升高，而SOD水平減少（P＜0.05）。表明H2O2可通過誘導氧化應激損傷引起海馬神經元凋亡，H2O2氧化應激損傷模型構建成功。

NA是一種對神經細胞有保護作用的阿片受體拮抗劑，可通過調控HSP60-TLR4 途徑介導炎癥反應而抑制小膠質細胞活化[2]，也可抑制神經細胞凋亡減輕腦缺血再灌注損傷[15]。研究顯示，NA可通過下調MDA 和上調SOD 水平發揮抗氧化作用[16]，但其是否通過抗氧化應激途徑減弱神經細胞凋亡而發揮神經保護作用并不明確。本研究首先以不同濃度NA作用小鼠海馬神經元，結果發現0.1 μmol/L和1 μmol/L NA 作用下神經元活力增強，無明顯毒性產生；以0.1 μmol/L 和1 μmol/L NA 與H2O2聯合作用后發現，H2O2引起的LDH 釋放量、MDA 水平、神經元凋亡率和Caspase-3活性升高以及SOD水平減少均明顯逆轉（P＜0.05）。結果表明，NA 可能通過抑制氧化應激損傷減輕海馬神經元凋亡。提示NA的神經保護作用與其抑制氧化應激損傷所介導的神經元凋亡有關。

MAPK 通路是細胞內重要的信號轉導途徑，其中JNK 和p38MAPK 是該途徑的重要組成部分；當受到外界應激刺激時，JNK 和p38MAPK 可通過磷酸化被激活，而激活的JNK/p38MAPK 具有促進細胞凋亡的作用，與神經損傷密切相關[17]。研究顯示，氧化應激誘導劑H2O2可通過激活JNK和p38MAPK通路誘導神經細胞凋亡[18]；而NA 具有抑制JNK 和p38MAPK 通路活化的作用[19-20]。本研究發現，200 μmol/L H2O2可誘導神經元JNK和p38MAPK磷酸化水平明顯升高，而給予NA作用后，H2O2誘導引起的上述變化明顯受到抑制（P＜0.05）。結果表明，NA 可抑制H2O2誘導的神經元JNK/p38MAPK 通路活化。提示NA抑制氧化應激損傷所介導的神經元凋亡可能與其抑制JNK/p38MAPK通路活化有關。

綜上所述，NA可能通過抑制JNK/p38MAPK通路活化減輕H2O2誘導的海馬神經元損傷，進而抑制海馬神經元凋亡，發揮神經保護作用。然而，NA抑制JNK/p38MAPK 通路活化的詳細機制，還有待后續進一步深入探討。