白藜蘆醇對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4細(xì)胞惡性生物學(xué)特征及PI3K/Akt信號通路影響*

劉衛(wèi)國，張 情，侯俊杰，劉 泉，何育威，何利芳Δ

（1.長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院甲乳外科，仙桃 433000；2.黃石市中心醫(yī)院甲乳外科，黃石 435000）

甲狀腺乳頭狀癌約占所有甲狀腺癌的80%，是甲狀腺最常見的惡性腫瘤甲狀腺[1]。據(jù)研究報道，甲狀腺乳頭狀癌的年發(fā)病率正顯著上升[2-3]。雖然甲狀腺乳頭狀癌惡性程度不高，但由于其發(fā)病隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，且與甲狀腺良性結(jié)節(jié)比較相似，不易鑒別，容易導(dǎo)致頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而錯過最佳治療時間，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[4]。目前對于甲狀腺乳頭狀癌的治療以手術(shù)、化療和放療等方式為主。此外，積極情緒可以改善甲狀腺癌患者的癌因性疲乏，從而影響患者的預(yù)后[5]。雖然這些醫(yī)療手段對該疾病具有一定的改善作用，但部分患者對化療產(chǎn)生耐藥性影響了患者的預(yù)后，所以在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生轉(zhuǎn)移之前尋求新的藥物尤為重要。白藜蘆醇是一種天然的多酚類物質(zhì)，具有多種藥理活性，包括抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化應(yīng)激以及降血脂等[6]。據(jù)相關(guān)研究報道，白藜蘆醇可以在多種癌癥中發(fā)揮抗癌功效，如乳腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌等[7]。Yuan 等[8]研究報道白藜蘆醇通過AKT/GSK-3beta/Snail信號通路逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wu等[9]通過體外實驗，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制THJ-16T 和THJ-21T 細(xì)胞增殖，從而在間變性甲狀腺癌中發(fā)揮療效。董成龍等[10]通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但對于白藜蘆醇在甲狀腺乳頭狀癌中是如何發(fā)揮抗癌作用的，其具體機制尚無定論。因此，本研究探究了白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)特征的影響以及其作用機制，以期為甲狀腺乳頭狀癌的臨床治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要細(xì)胞、藥物及試劑

白藜蘆醇（貨號：501-36-0）購自蓋德化工網(wǎng)；人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4細(xì)胞株購自上海傳秋生物科技有限公司；LY294002 抑制劑（貨號：934389-88-5）和四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazo-lium，MTT；貨號：13183-79-4）均購自Sigma-Aldlrich公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI；貨號：25535-16-4)購自上海源葉生物；DMEM 培養(yǎng)液（貨號：D6046）購自Worldrm 生物商城；RPMI-1640 培養(yǎng)基（貨號：BC-B-021）和胎牛血清(貨號：JLAQ-110)購自鄭州九龍生物公司；青霉素（貨號：BC-CE-012）購自南京生航生物技術(shù)有限公司；鏈霉素（貨號：57-92-1）購自上海穎心實驗室；胰酶（貨號：8049-47-6）購自ChemicalBook公司；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒（貨 號：PRTD1) 購 自Cyanagen Srl 公 司；MatrigelTM 底膜基質(zhì)(貨號：354230)購自上海索寶生物科技有限公司；Bax 抗體（貨號sc-7480）、抗體Bcl-2（貨號：sc-7382）、PI3K抗體（貨號：sc-365290）、Akt 抗體（貨號：sc-5298）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GADPH；貨號：51332）和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自Santa Cruz公司；Caspase-3抗體(貨號：9662）均購自CST 公司；T-AOC 試劑盒（貨號：E-BC-K225-M）購自Elabscience公司；Transwell小室北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；人工基底膜（貨號：354234）購自北京盈豐大通科技有限公司；PBS 溶液(貨號：D8537）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-GFP/PI 雙染試劑盒（貨號：FY600016-20T）購自弗元生物科技有限公司；

1.2 儀器

Being BPN-RHP CO2培養(yǎng)箱購自集思儀器；EPS-300 電泳儀購自上海巴玖實業(yè)有限公司；JS-680D 凝膠成像儀購自杭州得聚儀器設(shè)備公司；1703940 半干電轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；BDF-25V270 低溫冰箱購自博科公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；MH-2 型微型振蕩儀購自北京銘成基業(yè)科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將IHH4 細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640 培養(yǎng)基中，其中添加了10%胎牛血清以及100 U/mL 的青霉素和鏈霉素。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到75%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.4 細(xì)胞分組

先用RPMI 1640 培養(yǎng)基將白藜蘆醇進行稀釋，使其濃度變?yōu)?5 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L。再將IHH4 細(xì)胞進行如下分組：不經(jīng)白藜蘆醇藥物處理的作為對照組，經(jīng)25 μmol/L 藥物處理的作為低劑量組，經(jīng)50μmol/L藥物處理的作為中劑量組，100μmol/L 藥物處理的作為高劑量組，經(jīng)50μmol/L LY294002 PI3K/Akt 信號通路抑制劑處理的作為抑制劑組。

1.5 MTT實驗

收集對數(shù)期的IHH4細(xì)胞，接種于96孔板上，使細(xì)胞密度為1×104個/mL，培養(yǎng)1 d后，按照實驗分組加入各藥物處理，分別向各孔加入100μL對應(yīng)的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。接種結(jié)束后在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，去除上清液，用培養(yǎng)液沖洗3 次以去掉藥液。然后加入50 μL(1 mg/mL)的MTT 溶液，培養(yǎng)4 h 后，再加入二甲基亞砜(150μL/孔)使沉淀溶解，然后用微型振蕩儀振蕩12 min，在490 nm 波長下，通過酶標(biāo)儀測出每孔吸光度(opticaldensity，OD)值，取3 孔計算平均OD值。將不加任何細(xì)胞的一孔作為空白，無藥血清作為對照組，從而計算出細(xì)胞生長抑制率%，計算公式：增殖抑制率（%）=(1-實驗組OD 值/對照組OD值)×100%。

1.6 Transwell實驗

用Transwell 法檢測IHH4 細(xì)胞的侵襲能力。IHH4 細(xì)胞在100μL 含血清的DMEM 中培養(yǎng)，將細(xì)胞置于含有Transwell 預(yù)涂的基質(zhì)凝膠膜過濾器的上腔內(nèi)，在24 孔板培養(yǎng)板上插8 μm 孔。培養(yǎng)48 h后，用棉簽去除上膜上殘留的細(xì)胞。侵襲細(xì)胞膜的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。隨機選取5 個視野在100 倍顯微鏡下觀察，侵襲細(xì)胞數(shù)用Adobe Photoshop CS6 計數(shù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

1.7 細(xì)胞流式術(shù)

采用胰酶將對數(shù)生長期的IHH4細(xì)胞進行消化以調(diào)整其密度，然后將IHH4細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板中（4×103個/孔）。按照實驗分組加入各藥物處理，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，消化細(xì)胞后加入100μL二甲基亞砜、20 μL AnnexinV-FITC及和20μL PI染液，混勻后于37℃下避光反應(yīng)20 min，在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞的凋亡情況。在消化后細(xì)胞內(nèi)加入70%乙醇溶液固定1 h，PBS溶液清洗細(xì)胞后加入PI進行染色重懸，置于流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞周期變化。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K 和Akt 蛋白的表達(dá)量。取對數(shù)生長期IHH4 細(xì)胞，進行消化使其密度為1×105個/mL，然后通過6孔板進行接種。按照實驗分組加入各藥物處理，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，吸去培養(yǎng)液，用3 mL 預(yù)冷PBS 洗滌3 次，然后在SDS 樣品緩沖液中煮沸。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，半干法轉(zhuǎn)到PVDF 膜，然后用5%脫脂奶粉，在37 ℃搖床中封閉1 h。將膜與Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K 和Akt（1:1 000）的一抗在4 ℃下過夜。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:10 000）作為二抗，加入二抗在37 °C 環(huán)境中培養(yǎng)1 h，顯色成像并通過Image-ProPlus 軟件對圖片條帶進行灰度值分析，以GADPH（1:1 000）作為內(nèi)參蛋白，計算各蛋白的相對水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制IHH4細(xì)胞的增殖能力

MTT 實驗結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的推移，對細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增大。同一時間點，與對照組相比，低、中、高劑量組和抑制劑組中IHH4 細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高；且劑量越高，對細(xì)胞增殖能力的抑制效果越顯著（P＜0.05），相比高劑量組，抑制劑組中IHH4 細(xì)胞的增殖抑制率無顯著改變（P＞0.05），見圖1，表1。

表1 各組IHH4細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果比較 ，%，n=3

表1 各組IHH4細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果比較 ，%，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

圖1 白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 白藜蘆醇抑制IHH4細(xì)胞的侵襲

Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（250.45±18.63）個、低劑量組為（180.64±16.15）個，中劑量組為（140.01±12.82）個，高劑量組為（93.43±7.64）個以及抑制劑組為（91.03±5.25）個（F=77.782，P＜0.001）；與對照組相比，低、中、高劑量組以及抑制劑組的穿膜細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)出不同程度的減少，且隨白藜蘆醇劑量逐漸增高，穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 Transwell實驗檢測各組細(xì)胞侵襲數(shù)

2.3 白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞凋亡及周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)評估白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞的凋亡及周期的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，低、中、高劑量組和抑制劑組均可有效的促進IHH4 細(xì)胞的凋亡，致使細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1 期阻滯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2，圖3。

表2 各組IHH4細(xì)胞的凋亡及周期情況 ，%，n=3

表2 各組IHH4細(xì)胞的凋亡及周期情況 ，%，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

圖3 IHH4細(xì)胞凋亡染色圖

2.4 白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，低、中、高劑量組以及抑制劑組中的Bax 和Caspase-3 蛋白水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2 的蛋白水平顯著下調(diào)(P＜0.05）；劑量越高，效果越顯著(P＜0.05)，見圖4，表3。

圖4 白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞凋亡蛋白水平的影響

表3 各組凋亡蛋白水平比較 ，n=3

表3 各組凋亡蛋白水平比較 ，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

2.5 白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的影響

蛋白印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，低、中、高劑量組以及抑制劑組中PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05)，劑量越高，效果越顯著(P＜0.05)，見圖5，表4。

圖5 白藜蘆醇對IHH4細(xì)胞通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 各組通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果比較 ，n=3

表4 各組通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果比較 ，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤之一，由于其生長和轉(zhuǎn)移速度較快，容易頻繁復(fù)發(fā)，影響患者的預(yù)后[11]。因此，在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生轉(zhuǎn)移之前尋求新的藥物已成為治療甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)鍵。白藜蘆醇作為一種多酚類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)血脂代謝等多種生物活性。鑒于近幾年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在癌癥進展的主要階段中均具有抗癌活性，是目前公認(rèn)最有潛力的天然抗癌藥物之一[12-13]。

癌細(xì)胞增殖、侵襲是導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，腫瘤惡化的特征。凌科技等[14]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力，發(fā)揮抗癌作用。在本研究中，通過MTT 實驗和Transwell 小室實驗，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制甲狀腺乳頭狀癌IHH4細(xì)胞的增殖和侵襲能力，且隨著白藜蘆醇劑量的增加而增強。此外，高劑量的白藜蘆醇和PI3K/Akt信號通路抑制劑對IHH4細(xì)胞的增殖和侵襲能力的抑制程度無顯著差異。PI3K/Akt 信號通路調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡、能動性、侵襲和細(xì)胞內(nèi)運輸，并在腫瘤的進展中起關(guān)鍵作用[15]。當(dāng)生長因子將PI3K 激活后，激活的PI3K使細(xì)胞膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇變?yōu)?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，然后，磷酸肌醇依賴的蛋白激酶激活A(yù)kt，活化的Akt 使GSK-3、caspase-9 等蛋白磷酸化，從而促進細(xì)胞的增殖[16]。當(dāng)PI3K/Akt 信號通路被激活后，可促進細(xì)胞內(nèi)Snail、Twist、ZEB等核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)的鈣粘附蛋白E 的水平，而當(dāng)鈣粘附蛋白E降低后，細(xì)胞黏附能力會下降，細(xì)胞的運動和侵襲能力也隨之增強[17]。以上結(jié)果提示，白藜蘆醇可抑制IHH4 細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可能與PI3K/Akt信號通路受到抑制有關(guān)。

凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，能有序和有效地去除受損細(xì)胞，與很多疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，包括癌癥[18]。已有相關(guān)研究表明，白藜蘆醇可促進多種癌細(xì)胞的凋亡，包括甲狀腺癌[19-21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白藜蘆醇和抑制劑處理后甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4 細(xì)胞的凋亡率顯著升高。Bax，caspase 3，Bcl-2作為經(jīng)典的凋亡蛋白，其中Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax促進細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)，二者可結(jié)合成異質(zhì)二聚體而失活，而當(dāng)二者的相對表達(dá)量失衡時，可破壞線粒體膜的完整性，最終激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡進程的改變[22]。在凋亡相關(guān)蛋白檢測實驗中，發(fā)現(xiàn)IHH4 細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇和抑制劑干預(yù)后Bax和Caspase-3蛋白水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白水平明顯下調(diào)。有研究顯示，當(dāng)抑制PI3K/Akt信號通路可以抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)，從而促進甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的凋亡[23]。這些論據(jù)說明白藜蘆醇能促進甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進凋亡終末效應(yīng)因子Caspase-3 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生長。失控性生長是腫瘤惡化的特征，主要是因為細(xì)胞周期發(fā)生紊亂。本研究經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和抑制劑可以有效地促進甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4 細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1 期阻滯。研究顯示，抑制PI3K/Akt 信號通路可使人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞阻滯于G1 期[24]，而細(xì)胞從G1 向S 期的轉(zhuǎn)化是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵限速步驟之一，因此推斷，IHH4 細(xì)胞發(fā)生周期延長或阻滯，使得DNA 合成受阻，抑制細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。既往研究表明，白藜蘆醇通過抑制PI3K/Akt 信號通路從而抑制肺癌細(xì)胞的活力，并促進肺癌細(xì)胞凋亡[25]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)白藜蘆醇和抑制劑處理后細(xì)胞中PI3K、Akt 蛋白表達(dá)下降，因此推斷，白藜蘆醇促進甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)PI3K/Akt 信號通路有關(guān)。關(guān)于白藜蘆醇在甲狀腺乳頭狀癌中的療效以及具體機制還有待進一步實驗進行探索與證實。

綜上所述，白藜蘆醇抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖和侵襲，影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關(guān)。