LINC02532調控miR-194-3p/HMGB1分子軸對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響*

王樹民，張 朔

（青海省第五人民醫院燒傷整形科，西寧 810000）

瘢痕疙瘩繼發于皮膚損傷，是以成纖維細胞異常增殖、細胞外基質成分過度沉積為特征的良性皮膚腫瘤，伴有瘙癢、疼痛，不隨時間自發消退。局部類固醇激素治療、冷凍治療、放射治療、激光治療、手術切除等治療效果均不佳[1]。近年來，長鏈非編碼RNA（lncRNA）被認為是腫瘤增殖、轉移過程的重要調控因素，其通過與miRNA特異結合間接調控靶mRNA表達參與腫瘤的發生、進展[2-3]。LINC02532是一種胃癌致癌性lncRNA，其上調與高臨床分期、低分化相關，并促進胃癌細胞惡性表型[4]。目前LINC02532 在瘢痕疙瘩進展中的作用尚未闡明。研究證實，瘢痕疙瘩中miR-194-3p 表達較低，miR-194-3p 過表達抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）增殖和遷移[5-7]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種與轉錄因子相關的核內DNA結合蛋白，人瘢痕疙瘩組織HMGB1 中高表達，可誘導人真皮成纖維細胞增殖，促進膠原合成[8]。DIANA Tool 軟件預測發現，miR-194-3p 與LINC02532、HMGB1 存在結合位點，于是推測LINC02532 可能調控miR-194-3p 和HMGB1在瘢痕疙瘩進展中發揮作用。本研究通過檢測瘢痕疙瘩組織中LINC02532、miR-194-3p 表達，分析干擾LINC02532表達、過表達miR-194-3p對HKF增殖和凋亡的影響，驗證LINC02532、miR-194-3p和HMGB1 之間的關系，為瘢痕疙瘩的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 組織樣本采集 收集2016 年1 月至2017 年1月青海省第五人民醫院整形外科手術切除的瘢痕疙瘩組織（研究組）23例，其中男9例，女14例；年齡16～53歲，平均（36.3±6.8）歲；耳垂5例，腹部7例，肩部6 例，上臂5 例。同期收集正常皮膚組織（正常組）23例，為我科住院手術患者供皮區皮膚，其中男9 例，女14 例，平均（35.4±7.3）歲。本研究已取得本院醫學倫理委員會批準。

1.2 細胞和試劑 HKF（上海雅吉生物科技公司）；DMEM 培養基、胎牛血清、青—鏈霉素雙抗（美國Gibco 公司）；PrimeScript 逆轉錄酶試劑盒（大連takara生物公司）；SYBR?Green Supermix預混液（上海伯樂生命醫學產品有限公司）；miR-194-3p 模擬物（mimics）及其對照（miR-NC）、miR-194-3p抑制劑（anti-miR-194-3p）及其對照（anti-miR-NC）、LINC02532 小干擾RNA（si-LINC02532）及其對照（si-NC）（上海生工生物工程公司）；細胞計數試劑盒（CCK-8）（福州飛凈生物科技）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin v-FITC）凋亡檢測試劑盒（北京百奧萊博生物公司）；兔抗人HMGB1 多克隆抗體、兔抗人GAPDH 單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海碧云天生物公司）。

1.3 RT-qPCR 檢測LINC02532 和miR-194-3p 瘢痕疙瘩組織中表達 采用總RNA快速分離試劑盒提取研究組、正常組標本的總RNA。以PrimeScript逆轉錄酶試劑盒進行逆轉錄反應，采用SYBR?Green Supermix 在ABI 7500 型熒光定量PCR 儀上進行RT-qPCR。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40 個循環。LINC02532 引物（上游5’-TCCTGGTGCCACTGAGACTGTG-3’；下 游5’-AGCCTCCATGATTCCTGCCTCTAG-3’），GAPDH（上游5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’），miR-194-3p（上游5’-GCCAGTGGGGCTGCTGT-3’，下游5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’），U6（上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下 游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’）。LINC02532（內參為GAPDH）和miR-194-3p（內參為U6）表達量以2-ΔΔCt法計算。

1.4 細胞培養和轉染 HKF用含89%DMEM+10%胎牛血清+1%青—鏈霉素雙抗的培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。3 d換液一次，收集第3代對數生長期的HKF進行實驗。按照2×105個/孔的密度在6孔板鋪板，細胞60%融合后嚴格按照Lipofectamine 2000 說明書進行轉染，分為si-NC 組（轉染si-NC）、si-LINC02532組（轉染si-LINC02532）、miR-NC 組（轉染miR-NC）、miR-194-3p 組（轉染miR-194-3p mimics）、si-LINC02532+anti-miR-NC組（轉染si-LINC02532和anti-miR-NC）、si-LINC02532+anti-miR-194-3p（轉 染si-LINC02532 和anti-miR-194-3p）組。收獲轉染48 h 細胞，RT-qPCR 檢測LINC02532和miR-194-3p表達水平驗證轉染效果。

1.5 CCK-8法和集落形成實驗檢測細胞增殖

CCK-8 法：將轉染48 h 的HKF 接種于96 孔板，培養48 h 后，按照10 μL/孔加入CCK-8 溶液，在37 ℃下與細胞相互作用2 h。用酶標儀測定轉染細胞在450 nm處的吸光度（OD）值以表示細胞活力。

集落形成實驗：將轉染48 h 的HKF 按照1×103個/孔的密度接種于6孔板，加入2 mL培養基使細胞分散均勻。置于37 ℃培養箱孵育直到出現肉眼可見細胞集落。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%結晶紫染色30 min。顯微鏡下統計大于50個細胞的集落數。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將轉染48 h 的HKF 重懸于1×結合緩沖液中，調整為1×106個/mL的單細胞懸液。按照Annexin v-FITC試劑盒步驟對HKF 細胞進行暗室染色。流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.7 Western blotting法檢測HMGB1蛋白表達

RIPA 裂解法從各組HKF 中提取蛋白，SDSPAGE 電泳分離蛋白，并轉移到聚偏氟乙烯膜上。膜封閉后，分別使用兔抗人HMGB1 多克隆抗體（1∶800 稀釋）、兔抗人GAPDH 單克隆抗體（1∶500稀釋）4 ℃孵育24 h，再用羊抗兔IgG 二抗（1∶1 000稀釋）37 ℃孵育2 h。增強化學發光法進行顯影定影，以Quantity One 軟件分析結果，以HMGB1 蛋白條帶灰度值與內參GAPDH 灰度值的比值表示HMGB1蛋白表達量。

1.8 熒光素酶報告基因實驗 將含有miR-194-3p預測結合位點的LINC02532野生型（WT）序列或不含預測結合位點的突變型（MUT）序列分別克隆到psiCHECK-2 熒光素酶載體，構建重組熒光素酶報告載體WT-LINC02532、MUT-LINC02532。將含有miR-194-3p 預測結合位點的HMGB1-3’-UTR 的WT 序列或不含預測結合位點的MUT 序列分別克隆到psiCHECK-2 熒光素酶載體，構建重組熒光素酶報告載體WT-HMGB1、MUT-HMGB1。使用Lipofectamine 2000 轉染試劑將WT-LINC02532、MUT-LINC02532、WT-HMGB1、MUT-HMGB1 分別與miR-194-3p mimics、miR-NC 轉染到HKF 中。培養48 h后，收獲細胞。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測HKF細胞螢火蟲和海腎熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性以表示miR-194-3p 與LINC02532或HMGB1的結合程度。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.9 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LINC02532、miR-194-3p在瘢痕疙瘩中的表達

研究組LINC02532 表達量較正常組顯著升高（P＜0.05），而miR-194-3p 表達量較正常組顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 LINC02532、miR-194-3p的表達

2.2 LINC02532、miR-194-3p 和HMGB1 的靶向關系DIANA Tools 預測到miR-194-3p 與LINC02532序列存在特異性結合位點，Targetscan 預測到miR-194-3p 與HMGB1 的3’-UTR 區域存在特異性結合位點，見圖2A。與miR-NC 和WT-LINC02532（或WT-HMGB1）共轉染比較，miR-194-3p mimic 和WT-LINC02532（或WT-HMGB1）共轉染組HKF 細胞相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miRNC 和MUT-LINC02532（或MUT-HMGB1）共轉染比 較，miR-194-3p mimic 和MUT-LINC02532（或MUT-HMGB1）共轉染組HKF細胞相對熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2B、2C。表明miR-194-3p 是LINC02532 的靶基因，HMGB1是miR-194-3p的靶基因。

圖2 LINC02532、miR-194-3p和HMGB1的互補序列及熒光素酶活性檢測

2.3 干擾LINC02532 表達對miR-194-3p 和HMGB1表達的影響 與si-NC組比較，si-LINC02532組HKF 細胞LINC02532 表達水平、HMGB1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），miR-194-3p表達水平顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC 組比較，miR-194-3p 組HKF 細胞miR-194-3p 表達水平顯著升高（P＜0.05），HMGB1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與si-LINC02532+anti-miR-NC 組比較，si-LINC02532+anti-miR-194-3p 組HKF 細胞miR-194-3p 表達水平顯降低（P＜0.05），HMGB1蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 LINC02532、miR-194-3p mRNA及HMGB1蛋白表達的檢測

2.4 干擾LINC02532表達及miR-194-3p對HKF細胞增殖的影響 與si-NC 組比較，si-LINC02532 組HKF 細胞活力、集落形成數顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC組比較，miR-194-3p組HKF細胞活力、集落形成數顯著降低（P＜0.05）；與si-LINC02532+antimiR-NC 組比較，si-LINC02532+anti-miR-194-3p 組HKF 細胞活力、集落形成數顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 細胞活性和集落形成數的檢測

2.5 干擾LINC02532 表達及miR-194-3p 對HKF 細胞凋亡的影響 與si-NC組[（7.04±0.55）%]比較，si-LINC02532 組HKF 細胞凋亡率[（19.95±1.11）%]顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC 組[（7.13±0.45）%]比較，miR-194-3p組HKF細胞凋亡率[（24.05±1.10）%]顯著升高（P＜0.05）；與si-LINC02532+anti-miR-NC組[（20.00±1.03）%]比較，si-LINC02532+anti-miR-194-3p組HKF細胞凋亡率[（9.11±0.72）%]顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測HKF細胞凋亡

3 討論

lncRNA 是一類異質性RNA 分子，其通過轉錄激活、轉錄干擾、miRNA 調控多種機制參與多種細胞過程。近年來多種lncRNA被證實與瘢痕疙瘩發病機制有關，例如瘢痕疙瘩組織和成纖維細胞中lncRNA H19明顯上調，沉默H19能夠抑制I型膠原表達、抑制成纖維細胞增殖和轉移[9]。lncRNA同源異形盒基因A11反義RNA（HOXA11-AS）高表達可抑制HKF 凋亡，促進血管生成，促進瘢痕疙瘩形成[10]。因此，闡明lncRNA在瘢痕疙瘩發病機制中的作用有助于尋找有效的分子治療靶點。本研究結果表明，瘢痕疙瘩組織中LINC02532 表達顯著升高，轉染si-LINC02532干擾LINC02532表達顯著降低HKF 活力和集落形成能力，增加細胞凋亡率，這與Zhang 等[4]報道干擾LINC02532 表達的抗增殖特性一致，這表明通過干擾LINC02532可能通過調控HKF增殖和凋亡對瘢痕疙瘩進展具有抑制作用。

目前研究顯示，lncRNA主要通過lncRNA/miRNA/mRNA 分子軸發揮作用，例如lncRNA HOXA11-AS通過靶向miR-124-3p激活Smad5信號進而誘導I型膠原合成，促進瘢痕疙瘩形成[11]。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實LINC02532 與miR-194-3p之間的直接相互作用。既往研究表明，miR-194-3p 在脊柱骨肉瘤組織中表達降低，miR-194-3p 通過靶向基質金屬蛋白酶（MMP-9）抑制脊柱骨肉瘤細胞遷移和侵襲[12]。在乳腺癌中linc-ROR通過下調miR-194-3p促進乳腺癌細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，降低乳腺癌細胞對雷帕霉素的敏感性[13]。本研究發現瘢痕組織中miR-194-3p 表達明顯降低，過表達miR-194-3p 抑制HKF 增殖，促進HKF凋亡，這些數據證明miR-194-3p作為一種抑制因子抑制瘢痕疙瘩進展。HMGB1 是一種核蛋白，當細胞損傷時HMGB1移位到細胞質，在感染、炎癥和免疫反應等方面發揮作用[14]。HMGB1 表達改變與創面愈合質量有關[15]。HMGB1 還可介導成纖維細胞活性，加速HKF 遷移，導致皮膚異常瘢痕形成[16]。HMGB1 抑制劑顯著抑制HKF 增殖和自噬，誘導細胞凋亡，抑制膠原蛋白合成[17]，以上研究表明抑制HMGB1 表達對瘢痕疙瘩形成具有抑制作用。由于HMGB1 是miR-194-3p 的直接靶點，過表達miR-194-3p或干擾LINC02532均可下調HMGB1表達，而干擾LINC02532 可上調miR-194-3p 表達，提示瘢痕疙瘩中存在LINC02532/miR-194-3p/HMGB1分子軸。為證實干擾LINC02532 表達的作用依賴于miR-194-3p 表達增加，本研究進行回復實驗，結果顯示，抑制miR-194-3p 表達可減弱干擾LINC02532 表達對HKF 增殖、HMGB1 表達的抑制作用以及凋亡促進作用，這進一步表明LINC02532通過靶向miR-194-3p/HMGB1 分子軸從而調節HKF增殖和凋亡。

總之，本研究證實干擾LINC02532可能通過上調miR-194-3p/HMGB1分子軸抑制HKF增殖，誘導細胞凋亡，這表明LINC02532可能是治療瘢痕疙瘩的新靶點。