青蒿素衍生物抗癌活性研究

陳 歡 代天志 孫德群

(西南科技大學生命科學與工程學院 四川綿陽 621010)

近 20 年來，隨著經濟的快速增長和工業化的發展，空氣污染、生活方式改變、人口老齡化等使中國疾病譜發生了巨大變化，但是癌癥仍然是目前全世界人類死亡的最主要原因之一。在中國，男性最常見的癌癥類型是肺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌和食道癌，而乳腺癌、肺癌、結直腸癌、胃癌和宮頸癌是中國女性的主要癌癥類型[1]。我國每天將近有1萬人確診癌癥，這相當于平均每分鐘就會有7個人診斷出癌癥。除了實體瘤的患病率高外，近年來人們對白血病的關注度也逐漸增高，死亡率占各類腫瘤的第六位，預后差，且兒童是白血病的高發人群。在2010年前就有文獻報道我國的白血病患兒有200多萬，并且每年以3～4萬的速度增加[2]。癌癥越來越低齡化和多藥耐藥性的頻繁出現[3-5]，使尋找有效的新抗癌潛在藥物迫在眉睫。

青蒿素(Artemisinin)是我國科學家屠呦呦于1972年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離出的一種萜類化合物。經長期臨床研究表明，青蒿素是繼乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后最有效的抗瘧特效藥，曾被世界衛生組織稱作是“世界上唯一有效的抗瘧疾藥物”[6-8]。由于青蒿素在抗瘧疾上所做的巨大貢獻，人們掀起了對青蒿素研究的熱潮，近年來的許多研究表明，青蒿素及其衍生物不僅是天然的抗瘧疾藥，也是有效的抗癌藥。比如：青蒿琥酯對白血病、結腸、黑色素瘤、乳腺、卵巢、前列腺、中樞神經系統(CNS)和腎癌細胞具有抑制活性[9]；雙氫青蒿素對胰腺癌細胞、白血病細胞、骨肉瘤細胞和肺癌細胞也有顯著的抗腫瘤活性，而且青蒿酮表現出比青蒿素更好的活性，并與其他抗癌藥物有相當大的協同作用[10-11]。Galal等對60種腫瘤細胞株進行的體外抗腫瘤活性測定中，所合成的12種雙氫青蒿素縮醛二聚體對非小細胞肺癌、中樞神經系統腫瘤、白血病細胞等癌細胞的IC50值在0.019～8.700 μmol/L之間。課題組前期對青蒿素衍生物的研究數據也表明青蒿素衍生物抗癌活性的顯著及研究價值[12-14]。在進行相關的藥理機理研究中，人們發現青蒿素類化合物強大的抗癌作用歸因于一個特殊的活性結構——過氧基團。過氧基團與鐵和血紅素或血紅素結合蛋白的相互作用，不僅能擾亂癌細胞中相關鐵代謝，還促發自身細胞毒性，使癌細胞死亡[15-17]。除此之外，在細胞中被鐵激活的青蒿素類化合物會釋放高烷基化自由基和活性氧自由基，進而促進凋亡、抑制生長、抑制血管生成、抑制癌細胞侵襲、遷移、轉移和DNA損傷，激發相關細胞凋亡通路(線粒體凋亡通路、內質網凋亡通路)等一系列級聯反應。在癌細胞中高表達的轉鐵蛋白和低表達的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶，使青蒿素類化合物具有良好選擇性[18-20]。綜上所述，對青蒿素進行有效的結構修飾具有重要意義。

本文以青蒿素化學結構為基礎，設計并合成了新青蒿素衍生物D-21，并通過體外細胞活性實驗和一系列熒光染色實驗來證明新青蒿素衍生物D-21 的抗癌活性。

1 實驗前準備

1.1 主要試劑和儀器

試劑：DMEM，RPMI-1640，IMDM培養基，胰酶消化液，Hyclone；胎牛血清(FBS)，Natocor；四甲基噻唑藍(MTT)，中國碧云天生物技術公司；Hoechst 33258，Annexin V-FITC ，PI，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)，中國碧云天生物技術公司；阿霉素(DOX)，中國碧云天生物技術公司；苯丁酸氮芥，安耐吉化學公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、濃鹽酸，成都市科隆化學品有限公司。

儀器：XD20-RFL倒置熒光顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；5404型低速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；SH-1000 Lab型全波長酶標儀，Corona Electric；KG-SX-700型高溫蒸汽滅菌鍋；KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC；SW-CJ-1D型超凈工作臺，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 試劑的制備

DMEM完全培養基的配制：取20 mL FBS(胎牛血清)和2 mL青霉素鏈霉素溶液加入到DMEM基礎培養基至最終培養基體積為200 mL，使完全培養基中FBS約為10%,PS約為1%，并于4 ℃ 冰箱保存備用。

DMEM維持培養基的配制：取5 mL FBS(胎牛血清)和2 mL青霉素鏈霉素溶液加入到DMEM基礎培養基至最終培養基體積為200 mL，使完全培養基中FBS約為2.5%,PS約為1.0%，并于4 ℃ 冰箱保存備用。

RPMI-1640和IMDM完全培養基和維持培養基的配制方法同上。

MTT溶液的配制：稱取500 mg的MTT粉末，用100 mL的PBS(磷酸鹽緩沖溶液)溶解后，0.22 μm無菌濾膜過濾，EP管分裝并置于-20 ℃ 冰箱中避光保存備用。

三聯裂解液的配制：稱取SDS (十二烷基硫酸鈉)10 g，異丁醇5 mL，10 mol/L HCl 0.1 mL用雙蒸水溶解并配成100 mL 溶液，用0.22 μm的濾膜過濾后，滅菌常溫保存。

磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制：稱取1.600 g NaCl，0.040 g KCl，0.694 g Na2HPO4·12H2O，0.040 g K2HPO4溶解于200 mL超純水中，調節pH值為7.2～7.4，滅菌常溫保存。

1.3 細胞株

本文中用于研究的人正常肝細胞系L02、人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y、膠質瘤細胞系U118-MG、人肺癌細胞系A549、人結腸癌細胞系HCT-116、人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞系CCRF-CEM、人慢性髓原白血病細胞系K562和人早幼粒細胞白血病細胞HL-60均購自上海攬寶(Shanghai Labpal)。

1.4 新青蒿素衍生物D-21結構式

新青蒿素衍生物D-21由西南科技大學生命科學與工程學院藥物合成實驗室設計合成，并經氫譜、碳譜、質譜確定結構式。

m.p.: 60.1～61.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.97 (s, 1H), 7.92 (d,J=8.3 Hz, 1H), 7.16 (d,J=8.3 Hz, 1H), 6.00 (d,J=9.8 Hz, 1H), 5.52 (s, 1H), 3.56 ～3.46 (m, 8H), 2.74 (s, 1H), 2.40 (d,J=17.8 Hz, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.05 (d,J=14.4 Hz, 1H), 1.91 (d,J=13.7 Hz, 1H), 1.83 (s, 1H), 1.75 (d,J=16.1 Hz, 1H), 1.68 (d,J=13.7 Hz, 1H), 1.57～ 1.45 (m, 2H), 1.43 (s, 3H), 1.35 (d,J=36.8 Hz, 2H), 1.10～1.02 (m, 1H), 0.98 (d,J=6.1 Hz, 3H), 0.91 (d,J=7.1 Hz, 3H)。13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 165.01, 151.95, 134.37, 133.71,128.75, 125.15, 122.43, 104.41, 92.40,91.60,80.22,77.29,77.04,76.78, 55.18, 51.70,45.39,41.43,37.31, 36.29, 34.17, 32.07, 25.97,24.62,22.10,20.25,18.50,12.25。HRMS (ESI) m/z calcd. for [C27H37Cl2NO6H+]: 542.199 8, Found, 542.171 6。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

HCT-116，A549，SHSY-5Y，U118-MG細胞系所用培養液為DMEM完全培養基，CCRF-CEM，K562，L02細胞系所用培養基為RPMI-1640完全培養基，HL-60細胞系所用培養液為IMDM完全培養基。上述細胞均在條件為37 ℃，5% CO2的飽和濕度的細胞培養箱中培養。

2.2 MTT法測D-21抗腫瘤活性

2.2.1 貼壁細胞

(1)接種細胞：待細胞處于對數生長期時，用胰酶消化細胞，并用完全培養基將消化下來的細胞制成適當細胞數量的細胞懸液，將細胞接種到96孔板中，每孔100 μL。放入培養箱中培養。

(2)藥物的配制和細胞給藥：培養24 h后，用DMSO溶解待測化合物，配成初始藥物濃度為10 μmol/L，并用維持培養基配制最終藥物濃度為0.04，0.40，2.00，10.00，20.00，40.00 μmol/L 共6組，并設置空白對照組。輕輕吸棄培養板中舊的培養液，每孔中加入100 μL各濃度的藥物(每個濃度設3個復孔)，然后放入細胞培養箱中培養。

(3)檢測：細胞培養72 h后，輕輕吸棄培養板中舊的培養液，然后每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)溶液，培養箱中孵育4 h，吸棄孔內溶液，再向各孔加入100 μL DMSO溶解，并用酶標儀檢測波長為490 nm 的吸光值。按公式(1)計算待測化合物對腫瘤細胞的生長抑制率，并通過SPSS軟件計算其IC50。

抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組

平均OD值)×100%

(1)

2.2.2 懸浮細胞

(1)接種細胞與細胞給藥：待細胞處于對數生長期時，收集細胞，用維持培養基混懸細胞并制成適當濃度的初始細胞懸液，然后用此細胞懸液配制成含不同藥物濃度的最終細胞懸液，最后接種于96孔板中，每孔90 μL，每個濃度設3個復孔，然后放入細胞培養箱中培養。

(2)檢測：細胞培養72 h后，每孔加入20 μL濃度5 mg/mL的MTT溶液，培養箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL三聯裂解液，培養箱中孵育10 h，并用酶標儀檢測波長為570 nm的吸光值。按前述方法計算其IC50。

2.3 D-21對腫瘤細胞形態的影響觀測

取對數生長期的CCRF-CEM細胞接種于24孔板中，用維持培養基制成適當濃度的細胞懸液，用細胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.000，0.625，1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入培養箱中培養24 h，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞形態，并用ImageView軟件拍照保存。

2.4 D-21不同濃度和不同作用時間對腫瘤細胞的抑制試驗

收集處于對數生長期的CCRF-CEM細胞，用維持培養基制成適當濃度的細胞懸液，用細胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.00，0.05，0.10，0.50，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00 μmol/L，然后將此不同濃度的細胞懸液接種到96孔板中，每孔100 μL，每個濃度設3個復孔，放入孵箱中分別培養24，48，72 h，每組時間重復3次；用MTT法檢測波長在570 nm的吸光值，算出IC50值后，用軟件GraphPad Prism 8處理數值并繪制CCRF-CEM細胞經新青蒿素衍生物D-21不同濃度和不同作用時間處理的抑制活性曲線圖。

2.5 Hoechst 33258染色

2.5.1 藥物配制：用DMSO溶解待測化合物，配成初始藥物濃度為10 mmol/L，-20 ℃ 保存。

2.5.2 細胞接種及給藥：收集處于對數生長期的細胞，用維持培養基制成適當濃度的細胞懸液，用細胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.000，0.625，1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入孵箱中培養24 h。

2.5.3 染色：用EP管收集藥物作用后的細胞(1 000 r/min，5 min)，將Hoechst 33258儲備液用PBS稀釋成10 μg/mL，PBS洗細胞兩次后，每管加入稀釋后的染色液200 μL，室溫避光孵育20 min后，離心除去染色液，用PBS小心清洗細胞2次；將染色后的細胞重新接種于24孔板中，并在熒光顯微鏡下觀察拍照；整個過程盡量避光操作。

2.6 Annexin V-FITC and PI 染色

2.6.1 藥物配制：方法同2.5.1節

2.6.2 細胞接種及給藥：收集處于對數生長期的細胞，用維持培養基制成適當濃度的細胞懸液，用細胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入孵箱中培養24 h。

2.6.3 染色：用EP管收集藥物作用后的細胞(1 000 r/min，5 min)，PBS洗滌細胞，加入195 μL染色結合液重懸細胞后，再依次分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光20 min(期間可重懸細胞，以便細胞和染色液充分作用)，隨后將細胞接種于24孔板中靜置于冰浴片刻后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。整個過程盡量避光操作。

2.7 線粒體膜電位(JC-1)染色

2.7.1 藥物配制：方法同2.5.1節

2.7.2 細胞接種及給藥：收集處于對數生長期的細胞，用維持培養基制成適當濃度的細胞懸液，用細胞懸液稀釋藥物，使其最終藥物濃度為0.000，1.250，5.000，10.000，20.000 μmol/L，然后將含不同化合物濃度的細胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，放入孵箱中培養24 h。

2.7.3 染色：用EP管收集藥物作用后的細胞(1 000 r/min，5 min)，PBS洗滌細胞，加入1 mL細胞培養液和1 mL染色工作液，充分混勻后在培養箱中孵育20 min；孵育結束后，離心除去上清液(2 000 r/min ，4 ℃，4 min)，并用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌細胞2次；將JC-1染色緩沖液(1X)重懸的細胞接種于24孔板中，并在熒光顯微鏡下觀察拍照。整個過程盡量避光操作。

3 實驗結果與討論

3.1 化合物對8種腫瘤細胞系的抗腫瘤活性

本實驗采用MTT法測定了化合物對CCRF-CEM，SH-SY5Y，U118-MG，A549，HCT-116細胞系的抗腫瘤活性，用正常肝細胞L02來測定化合物的毒性。以雙氫青蒿素(DHA)、阿霉素(DOX)、苯丁酸氮芥(DZ)為陽性對照，如表1。通過實驗數據可以看出，本實驗室設計合成的新青蒿素衍生物D-21 對癌細胞普遍具有較好活性，特別是對白血病細胞系CCRF-CEM的增長抑制作用顯著，其 IC50值 0.602±0.252 μmol/L，達納摩爾級，這對潛在的抗腫瘤藥物的設計和篩選提供了實驗依據和思路。

因為很多研究已經表明含氮芥類的衍生物對結腸癌細胞系特別是白血病細胞系具有顯著的抗腫瘤活性[21-22]，為了進一步驗證本課題組合成的青蒿素衍生物是否對其他白血病細胞有抗增殖作用，我們又測定了新青蒿素衍生物D-21對人慢性髓原白血病細胞系K562和人早幼粒細胞白血病細胞HL-60 這兩株細胞系的抗細胞增殖作用。

從表1的總體數據可以得出，新青蒿素衍生物D-21 對所選的腫瘤細胞系均有較好抗增殖作用，特別是對白血病細胞株具有更強的細胞活性，且對急性白血病細胞系的抗增殖作用好于慢性白血病細胞系。因此，我們決定進一步研究新青蒿素衍生物D-21對CCRF-CEM細胞的初步抗腫瘤機制。

表1 青蒿素衍生物對8種細胞株的抑制活性(x±SD，n=3)Table 1 Inhibitory activities of new artemisinin derivative against eight cancer cell lines(x±SD，n=3)

3.2 D-21不同濃度和不同作用時間對腫瘤細胞生長的抑制作用

如圖1所示，新青蒿素衍生物D-21對CCRF-CEM細胞的生長有明顯的抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。當藥物(10 μmol/L)作用24 h后，細胞抑制率達50%以上，表明抑制效果顯著。

圖1 新青蒿素衍生物D-21不同濃度和不同作用時間對CCRF-CEM細胞的增殖抑制率曲線Fig.1 Proliferation inhibition rate curve of new artemisinin derivative D-21 on CCRF-CEM cells at different concentrations and time

3.3 D-21對腫瘤細胞形態的影響

一般來說，細胞形態的驟變、空泡的出現是腫瘤細胞早期凋亡的直觀表象，可以通過對腫瘤細胞外觀的觀察來初步判斷化合物對細胞的作用情況。如圖2所示，CCRF-CEM細胞經新青蒿素衍生物D-21處理后發生明顯的形態學變化。隨著新青蒿素衍生物D-21濃度的增加，細胞開始皺縮，細胞膜完整性受損，這種變化說明細胞骨架已崩解，細胞逐漸死亡，尤其是當新青蒿素衍生物D-21濃度達到 1.25 μmol/L時，細胞開始出現明顯的形態學變化，表明新青蒿素衍生物D-21細胞毒性作用顯著。

圖2 新青蒿素衍生物D-21作用后的CCRF-CEM細胞形態Fig.2 Morphology of CCRF-CEM cells after treated with a new artemisinin derivative D-21

3.4 Hoechst 33258染色結果分析

為了確定新青蒿素衍生物D-21誘導的抗增殖活性是否與細胞凋亡有關，進行了Hoechst 33258染色實驗。Hoechst 33258染色可初步評價細胞凋亡，經染料孵育后可直接觀察到細胞的熒光圖像。根據染色機理，正常細胞呈弱藍色熒光，凋亡細胞因凋亡導致染色質固縮而呈強藍色熒光。如圖3所示，新青蒿素衍生物D-21的加入使細胞比空白對照組表現出更亮的藍色熒光，并且呈現強熒光的細胞量明顯隨著藥物濃度的增加而增加。當新青蒿素衍生物D-21濃度在0.625 μmol/L時，孔板內就出現了形狀不同的凋亡小體，細胞質濃縮，說明新青蒿素衍生物D-21以濃度依賴的方式誘導細胞凋亡。

圖3 Hoechst 33258對新青蒿素衍生物D-21作用后的CCRF-CEM細胞染色圖Fig.3 Hoechst 33258 staining picture of CCRF-CEM cells after treated with a new artemisinin derivative D-21

3.5 Annexin V-FITC and PI 染色結果分析

為了進一步評價新青蒿素衍生物D-21的細胞活性是否與細胞凋亡有關，進行了Annexin V-FITC和PI染色實驗。Annexin V是一種膜黏蛋白，它能選擇性地與細胞膜中的磷脂酰絲氨酸結合。磷脂酰絲氨酸主要分布在細胞膜內部。當細胞發生凋亡時，會出現磷脂酰絲氨酸翻出到細胞膜表面的現象，這是細胞凋亡的重要特征。Annexin V-FITC是一種用綠色熒光探針FITC標記的Annexin V，根據Annexin V-FITC與磷脂酰絲氨酸的結合，就能知道磷脂酰絲氨酸在細胞膜表面的分布情況，從而檢測出細胞的凋亡狀態。PI可對凋亡后期壞死細胞或細胞膜失去完整性的細胞進行染色，然后呈現紅色熒光。本實驗通過Annexin V-FITC和PI雙重染色，可以更全面地驗證該化合物是否誘導細胞凋亡。如圖4所示，隨著化合物濃度的增加，綠色和紅色熒光明顯增強。表明新青蒿素衍生物D-21可明顯誘導細胞凋亡和壞死。

3.6 線粒體膜電位(JC-1)染色結果分析

細胞凋亡的機制之一是線粒體膜通透性的改變，隨后一些促凋亡因子釋放到細胞質內，引發一系列級聯反應然后促進細胞凋亡，其中凋亡現象之一就是線粒體膜電位的降低。在此，用熒光探針JC-1研究了新青蒿素衍生物D-21對線粒體膜電位的影響。JC-1是廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，可用于早期細胞凋亡的檢測。當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中形成一種聚合體(J-聚集體)并產生紅色熒光；當線粒體膜電位較低時，JC-1不能進入線粒體基質，JC-1以單體形式產生綠色熒光。因此，可以通過熒光顏色檢測線粒體膜電位的變化。如圖5所示，與對照組相比，新青蒿素衍生物D-21處理的CCRF-CEM細胞發散的綠色熒光強度明顯增強，且呈劑量依賴性。實驗結果表明，新青蒿素衍生物D-21可以通過改變線粒體膜的去極化誘導細胞凋亡。

圖5 新青蒿素衍生物D-21作用后的CCRF-CEM細胞線粒體膜電位(JC-1)染色圖Fig.5 JC-1 staining picture of CCRF-CEM cells after treated with a new artemisinin derivative D-21

4 結論與展望

新青蒿素衍生物D-21對結腸癌細胞HCT-116、肺癌細胞A549、人慢性髓原白血病細胞K562、人早幼粒細胞白血病細胞HL-6、人急性白血病細胞CCRF-CEM有顯著的抗增殖活性，使D-21躍升為抗癌藥成為可能?？拱┗钚缘某醪教接懸沧C明了隨著D-21濃度的增加，受線粒體膜電位相關凋亡通路影響，腫瘤細胞快速凋亡。

雖然人們對青蒿素及其衍生物已經進行了大量的研究，但是像新青蒿素衍生物D-21這種具有顯著抗癌活性的化合物卻未見報道。通過本文實驗可以充分證明新青蒿素衍生物D-21有非常大的潛在研究意義，可進一步研究新的藥理機理，為今后抗癌藥物的臨床研究提供實驗基礎。