定量檢測PAX1甲基化對于高級別宮頸癌前病變的診斷價值

林曉　徐軍　徐靈　夏子茵　朱昊平

(1.上海市閔行區中心醫院婦產科，上海　201199；

2.上海市計劃生育科學研究所臨床研究與培訓中心，上海　200032)

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·論著·

定量檢測PAX1甲基化對于高級別宮頸癌前病變的診斷價值

林曉1徐軍1徐靈1夏子茵1朱昊平2

(1.上海市閔行區中心醫院婦產科，上海201199；

2.上海市計劃生育科學研究所臨床研究與培訓中心，上海200032)

摘要目的：探討配對盒家族基因1(paired boxed gene 1, PAX1)的甲基化定量檢測對于高級別宮頸癌前病變的臨床診斷價值。方法： 以病理診斷為金標準，將122例高危亞型HPV病毒感染患者分為正常宮頸組(組I，n=39)、低級別宮頸癌前病變組(組II，n=40)和高級別宮頸癌前病變組(組III，n=43)。收集各組的宮頸組織標本，采用焦磷酸測序法檢測各樣本中PAX1基因的甲基化水平并進行統計學分析，繪制受試者工作特性(ROC)曲線，確定PAX1基因的甲基化水平對高級別宮頸癌前病變的診斷閾值。結果：組I的PAX1基因甲基化水平為(4.77±2.43)%，組II為(3.75±2.36)%，組III為(13.51±5.31)%，差異有統計學意義 (F=23.13，P<0.001)。ROC曲線下面積為0.73。PAX1甲基化水平用于診斷高級別宮頸癌前病變的診斷閾值為4.15%，靈敏度為89. 39%，特異度為79.15%。結論：采用焦磷酸測序法定量檢測宮頸組織中PAX1基因的甲基化水平能夠有效診斷高級別宮頸癌前病變。

關鍵詞宮頸癌前病變；焦磷酸測序法；配對盒家族基因1；甲基化

近20年來，細胞學篩查和HPV病毒捕獲雜交法的應用使許多宮頸癌前病變和早期浸潤宮頸癌得到早診斷、早治療，從而有效降低了宮頸癌的病死率[1-3]。但是，流行病學統計表明，絕大多數HPV感染的婦女并不發生宮頸癌，說明宮頸癌發生發展過程中還有其他協同因子發揮作用，故一些分子水平的檢測方法應運而生。

抑癌基因的異常甲基化可抑制抑癌基因的表達。有研究[1]表明，配對盒家族基因1(paired boxed gene 1, PAX1)的甲基化率異常升高與宮頸癌前病變的進展和宮頸鱗癌的發生密切相關。本研究旨在探索在高危型HPV陽性的人群中定量檢測宮頸組織細胞中PAX1基因的甲基化對宮頸癌前病變的診斷價值。

1資料與方法

1.1一般資料和分組以2012年3月—2014年10月在上海市閔行區中心醫院宮頸門診就醫的122例高危亞型HPV病毒感染者為研究對象；排除妊娠、惡性腫瘤史或免疫系統疾病史；入組前均簽署知情同意書。入組時進行宮頸組織活檢，收集宮頸組織以進行PAX1基因的甲基化檢測，同時進行病理學診斷并以此作為診斷“金標準”。根據病理學診斷結果，將122例分為正常宮頸組(組I)39例、低級別宮頸癌前病變組(CIN I，組II)40例、高級別宮頸癌前病變組(CIN Ⅱ~Ⅲ，組III) 43例。

1.2方法

1.2.1DNA提取及化學修飾應用德國Qiagen公司生產的Omniscript RT試劑盒。抽提DNA后經亞硫酸氫鹽處理。

1.2.2PCR及定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(QMSP)采用PCR對目標片段進行擴增。PCR所需引物F1(快速模式1)為5’-TAT TTT GGG TTT GGG GTC GC -3’，PCR引物R1(中速模式1)為5’-CCC GAA AAC CGA AAA CCG-3’，測序引物Sl(慢速模式1)為5’-TTT TTG TTT TAG AGA GGT TAG TAA T-3’。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40個循環；72 ℃延伸10 min。完成PCR后將反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳。涉及引物均由上海生工生物工程公司合成。QMSP擴增儀為美國安捷倫公司Mx PCR系統。QMSP反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共50個循環。

1.2.3焦磷酸測序甲基化定量采用焦磷酸測序法。按照美國Bio-Rad公司測序儀中的甲基化分析要求，配置所需混合液：0.1 mol/L氨丁三醇(TAM)緩沖液(pH值為7.7)，2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mmol/L MgAc2，0.1% 牛血清蛋白(BSA)，1 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，3 μmol/L 5’磷酸化硫酸腺苷(APS)，0.4 μg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.4 mmol/L D-蟲熒光素，2×10-4U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3U/L三磷酸腺苷雙磷酸酶，18×10-3U/L無外切酶活性的Klenow DNA聚合酶，14.6 mg/L熒光素酶。然后測量樣本基因的甲基化程度。將所測的PAX1基因的9個位點的甲基化程度(%)的平均值作為每份標本的甲基化程度。圖1舉例說明單個樣本中PAX1基因9個位點的甲基化水平。

圖1　單個樣本中PAX1基因各位點甲基化的定量檢測示例

2結果

組I平均年齡為(36.18±7.71)歲，組II平均年齡為(38.31±7.64)歲，組III平均年齡為(38.93±7.54)歲，3組間年齡差異無統計學意義(F=1.312，P=0.106)。組I、組II、組III的高危HPV病毒DNA定量平均值分別為389.85±395.71、483.23±702.79、683.28±623.75，3組間差異無統計學意義(F=1.470，P=0.203)。

組I、組II、組III的PAX1基因甲基化水平分別為(4.77±2.43)%、(3.75±2.36)%、(13.51±5.31)%。單因素方差分析表明，3組的PAX1基因甲基化水平差異有統計學意義(F=23.13，P<0.001)。采用dunnett方法進行組間多重比較發現，組I和組II之間的PAX1基因甲基化水平差異無統計學意義(P=0.317)，組I和組III(P=0.003)以及組II和組III(P=0.001)間差異有統計學意義。詳見圖2。

圖2　3組患者PAX1基因甲基化的比較

繪制PAX1基因甲基化水平用以區分高級別宮頸癌前病變與低級別宮頸癌前病變和正常宮頸的ROC曲線，ROC曲線下面積為0.73；用PAX1基因的甲基化水平進行高級別宮頸癌前病變診斷，診斷閾值為4.15%，此時靈敏度和特異度分別為 89. 39%、79.15%。見圖3。

圖3　PAX1基因甲基化水平檢測的ROC曲線(區分高級別宮頸癌前病變與低級別宮頸癌前病變和正常宮頸)

3討論

近年研究發現，在宮頸癌組織中，PAX1基因的甲基化水平異常增高。臺灣地區的一項研究[4]顯示， 宮頸癌組織中PAX1基因甲基化陽性率達89%以上。因此，PAX1有望作為宮頸癌早期診斷的分子標志物。但大多相關研究均為定性檢測PAX1基因的甲基化狀態，無法對甲基化的程度進行量化判斷，故在臨床上只能用于浸潤癌的診斷[2- 3]。

絕大部分宮頸癌是由HPV高危型病毒持續、反復感染所致，病變過程涉及病毒感染、癌前病變和浸潤癌三個主要階段，耗時可達十數年[2]。由于目前認為低級別宮頸癌前病變進展為浸潤癌的幾率極低，因此，及時篩查發現高級別的宮頸癌前病變是宮頸癌早期診斷和治療的關鍵。既往關于抑癌基因的甲基化檢測研究主要專注于浸潤癌的診斷方面，而對于宮頸癌前病變尤其是高級別宮頸癌前病變的分子診斷卻鮮有研究涉及[3-5]。

作為新一代DNA序列分析法，焦磷酸測序技術用于DNA序列分析時無需電泳和熒光標記，且可以同時檢測多個甲基化位點并獲得甲基化程度的精確定量值[6]。它不僅可以對甲基化程度進行定量測量，又具有很高的可重復性和極高的準確性，且成本也比其他高通量測序技術低[7]。本研究中焦磷酸測序結果表明，高級別宮頸癌前病變組織中PAX1基因的甲基化水平顯著高于低級別宮頸癌前病變組織和正常宮頸組織；我們通過繪制ROC曲線并進行相關分析，初步確立了用PAX1基因的甲基化水平進行高級別宮頸癌前病變診斷的診斷閾值為 4.15%，為進一步開展前瞻性研究提供了數據基礎。

值得注意的是，雖然本研究中所有研究對象均為HPV高危陽性且經病理學診斷確認有3個不同的病變級別，但不同病變級別患者之間HPV病毒DNA的定量值差異卻無統計學意義，且標準差范圍較大。這提示在宮頸疾病的篩查中，高危HPV分型更具有指導意義，而病毒DNA的定量水平并不能作為病變嚴重程度的依據[8]。

綜上所述，在高危HPV病毒感染患者中，采用焦磷酸測序法定量檢測宮頸組織細胞的PAX1甲基化水平對于診斷高級別宮頸癌前病變具有較高的靈敏度和特異度，在臨床上具有潛在的應用價值。

參考文獻

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[2]Kan YY，Liou YL，Wang HJ，et al． PAX1 Methylation as a Potential Biomarker for Cervical Cancer Screening[J]．Int J Gynecol Cancer，2014，24(5)：928-934.

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[5]徐軍, 徐靈, 王立峰, 等.子宮頸脫落細胞PAX1基因甲基化定量檢測在子宮頸癌早期診斷中的應用. 中華婦產科雜志, 2014, 49(9): 699-701.

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[7]Ye MH，Chen J，Lai MD．Pyrosequencing and its application in clinical diagnosis and therapy [J]．Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2013， 42(2)：138-142.

Diagnostic Value of Quantitative Detection of PAX1 Methylation for Cervical High Grade Precancerous Lesion

LINXiao1XUJun1XULing1XIAZiyin1ZHUHaoping21.DepartmentofObstetricsandGynecology,ShanghaiMinhangCentralHospital,Shanghai201199,China; 2.ClinicalTrail&TrainingCenter,ShanghaiInstituteofPlannedParenthoodResearch,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the clinical diagnostic value of quantitative detection of the paired-boxed gene1 (PAX1) methylation for cervical high grade precancerous lesions. Methods:According to pathological diagnosis, which was set as the gold standard, 122 patients infected with high risk subtype HPV were divided to the normal cervix group(group I,n=39), the cervical low grade precancerous lesions group(group II,n=40), and the cervical high grade precancerous lesions group(group III,n=43). The cervical tissue samples from each group were collected. The methylation level of PAX1 from each sample was measured by pyrosequencing and the statistical analysis was done. The diagnostic threshold of PAX1 methylation level for cervical high-grade precancerous lesions was verified by receiver operator characteristic(ROC) curve. Results: The PAX1 methylation level of group I, group II, group III was (4.77±2.43)%, (3.75±2.36)%, (13.51±5.31)%, respectively. And the differences among them were statistically significant (F=23.13，P<0.001). The area under the ROC curve was 0.73. The diagnostic threshold of PAX1 methylation level for cervical high grade precancerous lesions was 4.15%, and its sensitivity and specificity was 89.39% and 79.15%, respectively. Conclusions: Quantitative detection of PAX1 methylation level in cervical tissue by pyrosequencing could reach effective diagnosis for cervical precancerous lesions.

Key WordsCervical precancerous lesions;Pyrosequencing;Paired boxed gene 1;Methylation

通訊作者朱昊平，E-mail: misterporky2012@outlook.com

基金項目：吳階平醫學基金會臨床科研專項資助基金(編號：320.6750.13152)；上海市閔行區科委研究課題(編號：2012mhz065)

中圖分類號R 711.74

文獻標識碼A