循陽明經按摩對腦卒中大鼠神經功能的影響及其機制

趙金菊，石國鳳，謝蘊慧，溫丹果

(貴州中醫藥大學護理學院，貴州 貴陽 550025)

腦卒中是中國成年人群致死、致殘的首位病因。腦卒中后神經功能缺損導致患者肢體運動功能障礙、感覺障礙等，影響著患者的生活質量，給患者本人、家庭及社會帶來沉重的負擔。研究證實，早期正規介入功能康復訓練，可以促進腦梗死后神經功能恢復，改善其神經運動功能，提高患者的生活質量。其中循經按摩療法具有較好的臨床療效，但對腦梗死的作用機制仍不十分清楚。本研究對中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠偏癱側后肢循足陽明經進行按摩，觀察循經按摩對腦卒中大鼠模型血清腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表達及腦組織超微結構的影響，為循經按摩治療腦卒中神經功能障礙提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康SD大鼠80只，購于長沙市天勤生物技術有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2014-0011]，體質量為200～250 g，飼養于22 ℃環境下，12/12 h黑白交替，自由飲水攝食。適應性喂養1周。實驗嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》及實驗動物的倫理原則進行。

1.2 主要試劑 蘇木素染色液(批號 1113A18)：雷根生物；伊紅染色液(批號 C0109)、山羊血清(批號 C0265)、紅細胞裂解液(批號 C3702)：碧云天；RNAiso Plus (批號 9108)：Takara；GoldenstarRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2(批號 TSK302M)、2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)(批號 TSE002)：擎科；大鼠BDNF：慧嘉生物科技。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡(CKK53)：OLYMPUS；透射電子顯微鏡(JEM-1400 Plus、組織處理機(EM TP)：徠卡；微量紫外-可見光分光光度計(NanoDrop One/One C)：Thermo；PCR儀(T100)、水平電泳槽( Mini-Sub Cell GT)、核酸蛋白凝膠成像儀及CCD(Universal Hood Ⅱ)：Bio-Rad；實時熒光定量PCR儀(7500)：Thermo。

2 方法

2.1 模型復制方法及分組 采用10%水合氯醛以350 mg/kg的劑量腹膜內注射麻醉大鼠。參照Longa等方法阻塞右大腦中動脈。分離右頸總動脈，右頸內動脈和右頸外動脈，結扎右頸外動脈和右頸內動脈。在靠近右頸總動脈的右頸外動脈上做一個小切口，并用線栓緩慢插入約18 mm的深度以造成大鼠MCAO。阻斷供血2 h后，將線栓略微退回以允許再灌注2 h。對于假手術組，分開右頸外動脈、右頸總動脈和右頸總動脈但不作結扎。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、循經按摩組，每組24只。

2.2 干預方法 循經按摩組大鼠在模型復制24 h后給予循經按摩，用自制按摩儀，力量0.245～0.490 N、振動頻率2 Hz，循足陽明經的走向，按摩模型大鼠偏癱側后肢，持續治療10 min。循經按摩儀按摩后配合小按摩棒用點推法，循足陽明經推揉穴位：髀關、太沖、豐隆、足三里穴，重點推揉腓腸肌和大腿后部，以肢體微熱、大鼠能承受為度，持續10 min。上述操作每天進行2次。3天組、7天組、14天組、21天組分別干預3、7、14、21 d后取材。模型組及假手術組不給予任何干預。

2.3 觀察指標

2.3.1 神經功能評估 術后24 h參照Longa評分標準進行神經功能評分，評分為1～3分的大鼠被隨機分配以用于隨后的實驗。分別于干預后3、7、14、21 d進行再次評估。

2.3.2 光學顯微鏡下觀察腦組織細胞結構 所有洗滌樣品均用4%多聚甲醛固定，將這些組織進行脫水處理、透明處理。透明處理后，制成厚度為5 μm的石蠟切片，平放在防墜玻璃上，并放置在55 ℃的烘焙機中，以確保組織塊緊密地附著在玻片上，將切片進行脫蠟。所有樣品每個步驟后均用蒸餾水洗滌2 min，共3次。采用蘇木精染色10 min，在1%的鹽酸中，用乙醇脫色細胞質中過量的蘇木精染色液，伊紅染色持續30 s。用95%乙醇脫水2次，每次2 min。然后用二甲苯玻璃化兩次，每次5 min。最后采用中性樹脂進行封片。

2.3.3 透射電子顯微鏡觀察腦組織細胞結構 樣品先用3%戊二醛預混，再用1%四氧化鋨預混，然后用丙酮有序地脫水。用脫水劑和環氧樹脂分別以3∶1、1∶1和1∶3的比例進行滲透。每步持續30～60 min。將浸潤的樣品塊放置在適當的模具中，填充嵌入溶液，并嵌入到固體基體(嵌入塊)中進行加熱和聚合。用超薄切片機制備約50 nm厚的超薄切片，可在槽內液體表面漂浮，轉移到銅網上，先用醋酸鈾染色，再用檸檬酸鉛染色，室溫下放置15～20 min，用透射電子顯微鏡觀察。

2.3.4 實時定量PCR檢測BDNF mRNA表達水平 在最后一次干預后，采用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔內注射深度麻醉大鼠，從腹主動脈取血2 mL，提取總RNA，將獲得的總RNA保存于-80 ℃冰箱。分別取2 μL RNA提取物加入到微量分光光度計中，分別測定230、260、280 nm的吸收峰值和比值，計算各樣本中RNA的濃度和純度。按反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，隨后按照擴增試劑盒進行PCR擴增。BDNF上游引物：F-GTCCACGGACAAGGCAACT；下游引物：R-CAGCAGCTCTTCGATCACG。GAPDH上游引物：F-GCAAGTTCAACGGCACAG；下游引物：R-GCCAGTAGACTCCACGACATA。使用GAPDH作為內部對照計算BDNF mRNA的相對表達水平，使用2-ΔΔ法對結果進行定量。

2.3.5 采用酶聯免疫吸附法測定BDNF蛋白表達水平 取大鼠全血，離心后取血清，置于-80 ℃冰箱，備用，使用時置于冰面解凍。準備工作濃度標準品及樣品。加入檢測緩沖液、工作濃度標準品及樣品。加入檢測血清，使用封板膜封板，室溫孵育。加入辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素，使用新的封板膜封板，室溫孵育45 min。加入顯色底物TMB，避光，室溫孵育10～30 min。加入終止液，顏色由藍色變成黃色。采用酶標儀測量各孔光密度(optical density,OD)值。根據樣品的OD值，由標準曲線計算出濃度。將終止后的反應物置于酶標儀下檢測，在450 nm處讀取結果，以pg/mg的形式顯示。

3 結果

3.1 各組MCAO大鼠神經功能評分比較 MCAO模型復制后，與假手術組比較，模型組、循經按摩組大鼠各時間點神經功能評分均明顯提高(

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05)；與模型組比較，循經按摩組大鼠各個時間點神經功能評分均降低(

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05)。見表1。

表1 各組MCAO大鼠神經功能評分比較

3.2 各組大鼠皮質層、海馬層神經細胞形態和結構觀察 皮質層蘇木精-伊紅染色結果顯示，假手術組皮質層神經細胞排列整齊、結構完整。模型組損傷部位未見明顯的超時變化，神經細胞水腫隨著核周間隙的增加而受到嚴重影響，部分間質也出現炎癥細胞浸潤。與模型組相比，循經按摩組損傷部位神經細胞水腫的變性隨時間的推移而明顯減輕。蘇木精-伊紅染色結果顯示，假手術組海馬層神經細胞結構完整、核仁清晰。模型組海馬層神經細胞呈散射分布，細胞核固縮，并在間質中觀察到水腫。與模型組海馬層相比，循經按摩組神經細胞排列逐漸規律，且隨著時間的推移排列逐漸緊密。見圖1。

圖1 各組大鼠皮質層、海馬層細胞形態和結果觀察(蘇木精-伊紅染色，10×20倍)

3.3 透射電子顯微鏡下各組大鼠腦組織神經細胞變化 假手術組大鼠腦組織神經細胞核呈圓形，染色質分布均勻，核膜清晰完整，細胞質富含完整清晰的核糖體、髓鞘、微絲、線粒體，其中神經髓鞘相對致密。模型組大鼠腦組織神經細胞具有凋亡細胞的特點：腦樣本模糊，部分壞死神經細胞結構松散，細胞膜破裂，細胞質中大量線粒體腫脹，消失形成液泡的皺褶，染色質聚集，核膜完整但細胞體積收縮，髓鞘神經纖維變性和明顯的自噬。循經按摩組大鼠腦組織神經細胞核圓，染色質分布均勻，核膜清晰完整，細胞質中有線粒體、粗面內質網和核糖體。與模型組相比，循經按摩組大鼠腦組織神經細胞腫脹、自噬和凋亡明顯減少。見圖2。

注：黃色箭頭表示凋亡細胞；紅色箭頭表示腫脹的線粒體；綠色箭頭表示胞漿內空泡；藍色箭頭表示自噬

3.4 各組大鼠BDNF mRNA及蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組各個時間點大鼠BDNF mRNA及蛋白表達水平均明顯下調(

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05)；與模型組比較，循經按摩組各個時間點大鼠BDNF mRNA及蛋白表達水平均明顯上調(

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05)。見表2。

表2 各組大鼠BDNF mRNA及蛋白表達水平比較

4 討論

腦卒中已成為中國成年人死亡和致殘的主要原因，屬于中醫“中風”范疇，其中，缺血性腦卒中是其主要類型。腦缺血后腦組織炎癥反應是神經損傷的重要原因，炎癥反應導致神經細胞大量凋亡，凋亡后的神經細胞會失去原有功能，并且能阻斷細胞間的信號連接，進而加重腦卒中患者的神經功能障礙。腦缺血發生時，經MRI檢測發現海馬神經細胞的結構、數目及功能發生異常變化，導致神經組織、細胞受損，出現萎縮甚至自噬，導致神經再生障礙，嚴重影響著腦卒中后患者神經功能的恢復。

BDNF是一種神經營養因子，在中樞神經系統神經發生、神經保護和軸突導向中具有多種作用，與神經細胞損傷后再生修復密切相關。BDNF通過附著到Tropomyosin受體激酶B受體上，觸發下游信號傳導途徑，參與細胞的生長、增殖和神經重塑。有報道顯示，BDNF的大量分泌，能促進神經功能的恢復，改善神經細胞的微環境，使神經損傷得以修復。臨床研究結果顯示，提高腦梗死患者BDNF的表達，可以促進其神經功能的恢復。

研究表明，針灸、艾灸作用于穴位，能改善大腦氧代謝，促進腦側支循環的建立，增加腦血流量，具有神經保護作用，不僅能減少腦神經細胞的凋亡，而且能促進受損腦血管和中樞神經細胞的修復，重建受損的血腦屏障，維持其正常功能，減少梗死體積，并達到治療的作用。研究顯示，針灸、艾灸可以提高BDNF表達水平。

足陽明胃經是五臟六腑之海，是氣血生化之源。研究證明，刺激足陽明胃經產生的信號可傳入腦，影響腦神經的功能。陽明為氣血津液生化之源，主潤宗筋，陽明經對肌肉、筋骨具有重要的作用?！端貑枴ゐ粽摗分幸灿涊d“治痿獨取陽明”，陽明經是治療痿證的重要經絡。

本研究對腦卒中大鼠模型進行循足陽明經按摩，通過Longa評分評價各組大鼠神經功能評分。結果發現，循經按摩可以改善大鼠神經功能。通過PCR、ELISA檢測大鼠的全血BDNF mRNA及其蛋白表達水平，發現循經按摩組大鼠BDNF mRNA及其蛋白表達水平明顯高于模型組。采用蘇木精-伊紅染色法觀察了大鼠的腦組織，發現循經按摩可以恢復大鼠神經細胞的形態和結構。通過透射電子顯微鏡發現，循經按摩組大鼠腦組織神經細胞損傷、細胞凋亡和自噬較模型組減輕，表明循經按摩可以減少腦卒中大鼠腦組織神經細胞的損傷，修復神經細胞。推測其原因可能是循經按摩提高了BDNF的表達水平，進而促進神經細胞結構及功能的修復，改善神經功能。這與荊莉的研究具有一致性。

本研究結果表明，循經按摩能提高大鼠BDNF的表達水平，減輕腦組織神經細胞的凋亡，為循經按摩在臨床中的應用提供了理論依據，但發揮作用的機制尚未完全清楚，這將是下一步研究的目標。