芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證大鼠肺部炎癥和肺功能的影響

朱張求，石孟瑤，方 莉，朱 潔，李澤庚，3，童佳兵，3

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫藥科學院中醫呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種可預防和治療的慢性疾病，其主要特征為氣流受限并呈進行性發展。COPD發病機制復雜，其中炎癥機制是其主要的發病機制。慢性炎癥導致中性粒細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞等多種炎癥細胞浸潤在氣道、肺實質及肺血管，炎癥因子如白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)大量釋放，引起肺組織的滲出、水腫及黏液高分泌，導致氣道狹窄、痙攣及肺泡的通氣功能障礙，最終引起肺功能下降。

芪白平肺膠囊是安徽中醫藥大學第一附屬醫院研發的具有溫陽益氣、化痰散瘀作用的院內制劑，多年臨床研究證實該方能夠顯著改善COPD痰瘀阻肺證患者的炎癥狀態及肺功能，促進COPD的康復。為了進一步探究其作用機制，本研究觀察芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證模型大鼠的相關炎癥因子表達水平及肺功能的影響。

1 材料

1.1 動物 選用80只健康SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質量(230±20)g，由山東省動物實驗動物中心(動物合格證號:SCXK 20190003)提供。將其隨機分為正常組、模型組、脾氨肽組、芪白平肺膠囊組，每組20只。動物飼養于安徽中醫藥大學動物實驗研究中心，動物飼養室為清潔級,控制溫度在(22±2)℃。

1.2 藥物與試劑 芪白平肺膠囊(由黃芪、生曬參、川芎、薤白、葶藶子、五味子、地龍組成),由安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心提供，生產批號 20190805；脾氨肽口服凍干粉，每瓶2 mg，由大連百利天華制藥公司生產；IL-1β ELISA試劑盒(批號 JYM0419Ra)、IL-6 ELISA試劑盒(批號 JYM0646Ra)、IL-8 ELISA試劑盒(批號 JYM0583Ra)、TNF-α ELISA試劑盒(批號 JYM0635Ra)均購自武漢基因美科技有限公司。

1.3 儀器 動物實驗低氧裝置：上海塔望科技有限公司；2 m熏煙箱、大鼠強迫游泳槽：自制；紅梅牌香煙(焦油含量：13 mg；煙堿含量：1.1 mg)：紅塔卷煙集團；RT-6000酶標儀：深圳雷杜生命科學股份公司；JW3021HR離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司；GL-88B漩渦混合器：海門其林貝爾儀器制造公司；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱：上海三發科學儀器有限公司；RES3020小動物肺功能儀：北京貝蘭博科技有限公司。

2 方法

2.1 模型復制及給藥 參照相關模型復制方法,每天將模型組、脾氨肽組及芪白平肺膠囊組大鼠放入恒溫(43±1)℃水槽中強迫游泳30 min,使其勞累而耗傷肺氣；然后將大鼠置于2 m熏煙箱內被動吸煙,每天用20支去過濾嘴紅梅牌香煙煙熏一次，每次0.4 h。最后將大鼠置于常壓低氧并通入氮氣的低氧箱內，每天低氧7 h，用自動測氧儀控制氧濃度為10.0%±0.5%，通過傳感器將CO濃度維持在0.03%，溫度傳感器控制低氧箱內溫度始終恒定在22～24 ℃。蒸氣由變色硅膠(烘干后可反復使用)吸收。箱體由透明有機玻璃制造,可觀察大鼠活動、進食、飲水等情況。每日模型復制結束后，正常組及模型組大鼠予以0.9%氯化鈉溶液(10 mL/kg)灌胃，脾氨肽組每日將2瓶脾氨肽凍干粉(共4 mg)溶于100 mL 0.9%氯化鈉溶液中，然后按10 mL/kg對大鼠進行灌胃，芪白平肺膠囊組每日將10粒芪白平肺膠囊(共4 g)溶于80 mL 0.9%氯化鈉溶液中，煮沸冷卻至室溫后，然后按10 mL/kg對大鼠進行灌胃。連續復制模型1個月，每周一至周六復制模型，每周日喂食前將稱量大鼠體質量。當大鼠肺功能數據明顯降低，肺泡間隔明顯增厚或融合，大量炎癥細胞聚集在肺組織，即表明模型復制成功。

2.2 觀測指標及方法

2.2.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態、毛發、活動、爪甲及唇舌顏色、有無異常呼吸音、體質量、進食量、大小便等。

2.2.2 肺功能檢測 按2 mL/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥麻醉大鼠，于頸部正中切開皮膚，鈍性剝離肌肉組織，暴露氣管并切開，插入連接有三通開關的氣管插管并結扎，仰臥位放置于密閉體積描計器內，通過肺功能儀記錄第0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 seconds,FEV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、FEV0.3占FVC比值(FEV0.3/FVC)的數值。

2.2.3 血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平檢測 末次給藥后禁食12 h，從腹主動脈取血，采用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達水平。

2.2.4 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的采集 從腹主動脈采血后，繼續剪開大鼠頸部皮膚，并打開胸腔，剝離覆蓋肺組織的胸腺和心包，找到氣管分支，先結扎右主支氣管，然后將9號小鼠灌胃針經左主支氣管插入1 cm，并在灌胃針末端結扎，將4 ℃生理鹽水5 mL經氣管注入左主支氣管及左肺，等待約30 s后，反復回抽3次，回抽液3～4 mL，回收率為65%～85%，將回收液置于5 mL離心管中，于4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，吸取上清液，放置于2 mL冷凍管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。BALF離心后所得的細胞沉淀用1 mL滅菌的PBS重懸后，保存于2 mL冷凍管中，4 ℃冰箱中保存，用于細胞計數與分類計數。

2.2.5 肺組織病理檢查 采集BALF后，分離右肺上葉，經生理鹽水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面水分，然后置于4%甲醛固定48 h后進行石蠟包埋，切片，制片，最后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察肺組織病理形態。

3 結果

3.1 4組大鼠一般情況比較 模型復制結束后，正常組大鼠精神狀態佳，呼吸平穩，毛發光澤，食量正常，體質量逐漸增加；模型組大鼠精神狀態較差，喜靜惡動，毛發發黃欠光澤，呼吸音明顯較重，呼吸急促，部分大鼠肺部可聞及痰鳴音，唇舌部及爪甲發紺，進食量減少，體質量明顯減輕；脾氨肽組及芪白平肺膠囊組大鼠精神狀態佳，呼吸較平穩，無明顯異常呼吸音，毛發光澤，體質量逐漸增加，其中芪白平肺膠囊組大鼠一般狀態改善更為明顯。

3.2 4組大鼠肺組織形態比較 正常組大鼠肺泡結構完整,肺泡充氣狀態良好,肺泡間隔無明顯增厚，未見明顯炎癥細胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肺泡普遍局限性增大，肺泡間隔明顯增厚或損壞，支氣管壁可見明顯黏液腺增生，大量炎癥細胞聚集在肺實質和間質，同時可見部分肺泡萎縮塌陷，管腔變窄，符合COPD的病理改變。與模型組比較，脾氨肽組及芪白平肺膠囊組大鼠肺泡間隔大多正常，可見少量萎縮肺泡和融合肺泡，炎癥細胞浸潤明顯減少，氣管壁黏液腺增生明顯改善，其中芪白平肺膠囊組大鼠肺組織病理變化改善更為明顯。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.脾氨肽組；D.芪白平肺膠囊組

3.3 4組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高(

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05)；與模型組比較，脾氨肽組和芪白平肺膠囊組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(

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05)；芪白平肺膠囊組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著低于脾氨肽組(

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05)。見表1。

表1 4組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較

3.4 4組大鼠肺功能比較 與正常組比較，模型組大鼠的FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC顯著下降(

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05)；與模型組比較，脾氨肽組和芪白平肺膠囊組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC顯著升高(

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05)；芪白平肺膠囊組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC顯著高于脾氨肽組(

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05)。見表2。

表2 4組大鼠肺功能比較

3.5 4組大鼠BALF中白細胞總數及炎癥細胞比例比較 與正常組比較，模型組大鼠BALF中白細胞總數和單核-巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞比例均明顯升高(

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05)；與模型組比較，脾氨肽組和芪白平肺膠囊組大鼠BALF中白細胞總數和單核-巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞比例顯著降低(

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05)；芪白平肺膠囊組大鼠BALF中白細胞總數和單核-巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞比例顯著低于脾氨肽組(

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05)。見表3。

表3 4組大鼠支氣管BALF中白細胞總數和炎癥細胞比例比較

4 討論

COPD是一種高發病率及高致死率的慢性炎癥性疾病。COPD患者炎癥反應不僅影響到整個肺臟而且涉及全身，但是局部炎癥較重，直接或間接引起相關炎癥因子水平升高。IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子過度釋放，導致肺組織結構和功能的破壞，影響肺通氣和換氣，從而引起肺功能的下降，疾病進行性加重。如果不積極治療，則會引起高碳酸血癥、低氧血癥、肺動脈高壓等多種并發癥，危及患者生命安全。TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞分泌的一種重要的促炎因子，不僅可以誘導氣道內皮細胞表達黏附分子1及其mRNA表達，促進黏液分泌，引起肺組織的增生，同時可以介導IL-6、IL-8的合成及釋放，從而引起級聯反應，導致炎癥反應的進一步加劇。白細胞介素在炎癥反應中也有重要作用，如IL-6、IL-8、IL-1β可以通過誘導巨噬細胞、中性粒細胞聚集、淋巴細胞粘附，從而釋放溶酶體酶、蛋白水解酶和脂類介質等炎癥介質，激化氧化應激反應,從而產生對肺實質和肺血管的慢性損傷,參與或加重COPD氣道炎癥反應過程。本研究結果顯示，模型組大鼠FEV0.3/FVC較正常組顯著降低，提示其氣道阻力增加，存在氣流受限和肺通氣功能障礙，即肺功能降低，符合COPD模型的基本特征，表明模型復制成功。經脾氨肽及芪白平肺膠囊藥物干預后，大鼠血清炎癥指標、BALF中炎癥細胞浸潤明顯降低，肺組織病理及肺功能明顯改善，提示脾氨肽及芪白平肺膠囊均具有改善COPD痰瘀阻肺證大鼠炎癥水平和改善肺功能的作用，但芪白平肺膠囊的治療效果明顯優于脾氨肽。

中醫學將COPD歸屬“肺脹”范疇。《素問·大奇論》：“肺之壅，喘而兩脅滿。”其病理因素主要是“痰”“瘀”，患者初期多僅表現為咳嗽癥狀，隨著病情的發展，患者可出現咳痰、胸悶、喘息等癥狀，與COPD有許多相似之處。肺脹之初以氣虛為本，病本失治則漸累肺腎之氣。《素問·評熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛。”《證治準繩·喘》亦云：“肺虛則少氣而喘。”肺氣虛損，子盜母氣，則肺脾兩虛，水飲運化失調，聚為痰飲，壅塞肺道。此外，氣為血之帥，氣虛日久，血液運行受阻，則生瘀血。肺久病及腎，腎陽受損，蒸化失調，加劇痰飲的形成及壅塞肺道，且腎失納氣，則日久喘促。因此，益氣溫陽、化痰散瘀可為本病之治療大法。芪白平肺膠囊方中黃芪、生曬參合而為君，兩藥性溫而補元氣、益脾肺，共奏益氣溫陽之功。川芎辛散溫通，為“血中之氣藥”，活血行氣，使瘀去血行；薤白溫通辛散，理氣通陽，散陰寒邪氣；葶藶子辛散，善瀉肺中痰飲而平喘，且具行水消腫之功，上三者共為臣藥。五味子味酸性溫，能上斂肺氣止咳，下滋腎陰固腎平喘；地龍性散走竄，清肺定喘、通行經絡，合為佐藥。諸藥合用，共奏益氣溫陽、化痰散瘀之功。

脾氨肽是一種新型的免疫調節劑，是從健康動物脾臟中提取的肽及核苷酸類復合物，可單獨或協助用于感染性疾病、變態反應性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤性疾病的治療。脾氨肽進入人體后，作用于免疫信息傳遞、淋巴細胞活化和受體調節3個環節，通過調節Th1/Th2細胞因子平衡，提高機體的免疫功能，有效抑制炎癥反應。

現代藥理學研究發現：黃芪中黃芪多糖可調控Toll樣受體4/核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號轉導通路，降低相關炎癥遞質的含量，從而發揮抗炎作用；川芎可以阻礙相關炎癥信號傳遞,影響下游蛋白的表達,發揮抗炎作用；五味子總木脂素能夠調控NF-κB、過氧化物酶體增殖物激活受體等信號通路，抑制促炎因子的表達；地龍醇提物通過抑制毛細血管通透性，從而減輕肺部的炎癥滲出，改善肺功能；薤白可以通過6-酮前列腺素F1α下調IL-6、血栓素B的水平,從而抑制炎癥反應,緩解支氣管平滑肌的痙攣；葶藶子的化合物山柰酚可通過下調NF-κB信號通路，抑制下游炎癥因子分泌，從而發揮抗炎、抗氧化的重要作用；人參麥芽酚通過清除自由基抑制脂質過氧化物的形成。同時，相關研究發現，芪白平肺膠囊中揮發性成分乙酸乙酯、4-松油醇等成分具有明顯的平喘作用。因此，芪白平肺膠囊具有較好的抗炎和耐低氧作用。

綜上所述，芪白平肺膠囊可明顯改善COPD痰瘀阻肺證模型大鼠的肺組織病理損傷，改善其肺功能，這種作用可能與抑制炎癥反應有關。然而，COPD的發生機制較復雜，芪白平肺膠囊下調相關炎癥指標的作用通路尚未闡明，有待后續深入探究。