肝豆湯改良方調控PKR/eIF2α通路改善Wilson病模型TX小鼠突觸功能障礙的機制研究

劉松楊，程 楠，徐陳陳，董健健，高曼莉

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院，安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是由ATP7B基因突變引起以銅代謝障礙為表現的神經性遺傳病。部分WD患者，特別是腦型患者伴有較明顯的認知功能障礙，臨床主要表現為記憶力減退、學習能力下降等。安徽中醫藥大學神經病學研究所自1970年代開始使用具有清熱解毒、通腑利濕作用的肝豆湯治療WD患者獲得顯著臨床療效。肝豆湯改良方是在原肝豆湯組方基礎上加芍藥、山茱萸、三七等活血養髓藥物組成，該改良方可改善腦損傷與肝損傷WD患者的認知功能。實驗研究發現，肝豆湯改良方可通過調控細胞色素C(cytochrome-C, Cyt-C)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease, Caspase)信號通路達到減輕高銅誘導的海馬神經細胞損傷。雙鏈RNA依賴蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)作為一種泛素化蛋白激酶參與多種生理病理過程。銅沉積于腦中可引起氧化應激，激活PKR，激活后的PKR會進一步促使真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，促進細胞凋亡和抑制突觸相關蛋白的表達，導致突觸功能障礙。而突觸功能障礙是多數神經退行性疾病及認知功能障礙性疾病的致病機制之一。研究證實，高銅可通過激活PKR/eIF2α通路誘導神經細胞凋亡,抑制突觸相關蛋白表達，損傷突觸功能，降低小鼠的認知功能。高銅誘導的突觸功能障礙，可能是腦型WD患者出現認知功能損傷的重要機制，而肝豆湯改良方通過抑制PKR/eIF2α通路減輕高銅誘導的突觸功能障礙，改善WD患者認知功能。本實驗以毒牛奶(toxic milk，TX)小鼠為研究對象，基于PKR/eIF2α通路探究肝豆湯改良方改善高銅誘導的突觸功能障礙的作用靶點，旨在為肝豆湯改良方治療腦型WD患者認知功能障礙提供分子學實驗依據，為臨床中醫藥治療提供新的治療思路。

1 材料

1.1 動物 TX種鼠從美國Jackson動物實驗室中心引進，在中國科學院合肥物質研究院SPF級實驗動物中心飼養并傳代繁殖。動物由專人負責，環境溫度保持22～26 ℃，12 h光照，常規鼠類飼料喂養，自由飲水。TX小鼠是淡化致死基因(dilute lethal,DL)小鼠的自然突變品系，是理想的WD動物模型。本次實驗選擇DL和TX小鼠各40只，每只小鼠體質量為20～25 g。模型動物在入組前均進行基因檢測以確定種鼠及其子代的遺傳具有WD模型的特性。實驗動物使用許可證號：SYXK(皖)2018-005。

1.2 藥物及試劑 肝豆湯改良方：大黃、黃連、莪術、姜黃、芍藥各20 g，魚腥草、山茱萸各30 g，澤瀉24 g，三七3 g。藥物均購自北京同仁堂藥店安徽合肥分店，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。加入蒸餾水200 mL，浸泡30 min，大火煮沸后加入大黃，再以文火煎30 min，過濾至燒杯中，藥渣再加入蒸餾水200 mL，重復煎煮過濾。最后把2次藥液合并，文火濃縮至150 mL(含生藥2.2 g/mL)，冷卻后倒入棕色瓶內，并于4 ℃冰箱保存備用。Western及RIPA組織/細胞裂解液(R0020)：北京索萊寶科技有限公司；抗eIF2α抗體(ab5324)、抗p-eIF2α抗體(ab3398)、抗轉錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)抗體(ab3398)、抗促凋亡分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)抗體(ab5554)、抗突觸蛋白1(synapsin1)抗體(ab5297)、抗突觸素(synaptophysin)抗體(ab36406)、抗突觸后致密物-93(postsynaptic density-93，PSD-93)抗體(ab19046)、抗突觸后致密物-95(postsynaptic density-95，PSD-95)抗體(ab3450)：CST公司；抗PKR抗體(ab184257)：英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗(ZB-2301)：北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 儀器 Fine DO X6型全自動化學發光圖像分析系統：上海天能科技有限公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；PowerPac Basic型蛋白電泳儀及轉膜儀：美國伯樂公司；Dura 12FV實驗室超純水系統：美國The-Lab Corporation-澤拉布儀器科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥方法 正常組、正常加肝豆湯改良方組(DL小鼠各20只)，模型組、模型加肝豆湯改良方組(TX小鼠各20只)。正常組與模型組每日分2次予生理鹽水各20 mL/kg灌胃，連續4周；正常加肝豆湯改良方組與模型加肝豆湯改良方組每日分2次予中藥肝豆湯改良方各20 mL/kg(相當于60 kg成人臨床劑量的9倍)灌胃，連續4周。末次給藥結束后，取各組小鼠海馬組織進行檢測。

2.2 行為學檢測小鼠認知功能 分別從正常組、正常加肝豆湯改良方組、模型組、模型加肝豆湯改良方組中隨機抽取6只進行行為學實驗。

2.2.1 曠場實驗 試驗所需的裝置為長、寬各50 cm，高40 cm區域，其底部分為3個區域，邊緣區(1區)，中間區(2區)，中心區(3區)。1區距離曠場邊緣8 cm，3區占總區域面積的16%，剩下為2區。在曠場中的同一位置，將所有實驗小鼠面壁放入曠場中，記錄小鼠在曠場中5 min內的自由活動情況。所有實驗過程應用荷蘭Noldus公司的Ethovision XT監測分析系統進行檢測并分析。

2.2.2 Barnes迷宮 Barnes迷宮所需裝置高99 cm，直徑122 cm，有20個均勻分布的孔，距邊緣2 cm。這些孔的直徑10 cm、外觀均勻，只有一個孔連接到黑色可移動的逃生盒。訓練時，先將小鼠放在逃生盒30 s讓其熟悉環境，30 s后將小鼠拿到平臺并計時3 min觀察小鼠運動軌跡與能否找到逃生盒。共訓練4 d，每天2次，每次間隔30 min。在第5天進行測試，測試方法與訓練相同。記錄其找到目標洞口的潛伏期。

2.3 TUNEL染色法檢測小鼠海馬神經細胞損傷情況 取小鼠海馬組織進行固定、石蠟包埋、組織切片。TUNEL染色：切片常規脫蠟、抗原修復、TUNEL反應液室溫避光孵育、PBS漂洗、DAPI復染、PBS漂洗、封片。熒光顯微鏡下觀察采集圖像，TUNEL陽性表達呈綠色。采用Image J軟件對圖像進行定量分析。

2.4 免疫熒光檢測小鼠海馬8-羥化脫氧鳥苷(8-hydroxylated deoxyguanosine，8-OHdG)表達水平 取小鼠海馬組織進行脫水、浸蠟、包埋、切片。切片用一抗孵育4 ℃過夜、二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗、DAPI細胞核染色。熒光顯微鏡下觀察采集圖像，8-OHdG陽性表達呈紅色。Image J軟件對圖像進行定量分析。

2.5 Western blot檢測海馬PKR/eIF2α通路以及突觸相關蛋白表達水平 取小鼠海馬組織，通過BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白濃度。之后，將4倍蛋白上樣緩沖液添加到蛋白質溶液中，并加熱8 min以使蛋白質變性。制膠電泳轉膜，將蛋白樣本轉移至NC膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉4 h，TBST洗3次，每次10 min，一抗搖床4 ℃過夜。二抗搖床1.5 h，TBST洗3次，每次10 min。凝膠成像系統拍照，Image J軟件對圖像進行分析。

3 結果

3.1 肝豆湯改良方對WD模型TX小鼠認知功能的影響 曠場實驗結果顯示，模型組中央路程與中央時間顯著低于正常組(

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05)，邊上路程與邊上時間顯著高于正常組(

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05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組中央路程與中央時間顯著增加(

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05)，邊上路程與邊上時間顯著降低(

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05)。Barnes迷宮實驗結果顯示，模型組找到目標洞口的潛伏期顯著高于正常組(

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05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組小鼠找到目標洞口的潛伏期顯著降低(

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05)。見表1。

表1 各組小鼠行為學實驗結果比較

3.2 肝豆湯改良方對WD模型TX小鼠海馬神經細胞損傷的改善作用 與正常組比較，模型組海馬神經細胞凋亡數目顯著增加(

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05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬神經細胞凋亡數量顯著降低(

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05)。見圖1。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 肝豆湯改良方對WD模型TX小鼠海馬8-OHdG表達水平的影響 與正常組比較，模型組海馬8-OHdG表達水平顯著增加(

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05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組8-OHdG表達水平顯著降低(

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05)。見圖2。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 肝豆湯改良方對Wilson病模型TX小鼠海馬PKR/eIF2α通路及突觸相關蛋白表達水平的影響 與正常組比較，模型組海馬PSD-93、PSD-95、Synapsin-1、Synaptophysin蛋白表達水平均顯著降低(

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05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬PSD-93、PSD-95、Synapsin-1、Synaptophysin蛋白表達水平均顯著增加(

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05)。見圖3。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

與正常組比較，模型組海馬PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平均顯著增加(

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05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平均顯著降低(

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05)。見圖4。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

銅是人體必需的一種金屬微量元素，對中樞神經系統功能的維持具有必不可少的作用。而環境或遺傳因素所致的體內銅缺乏或沉積均會導致中樞神經系統損傷。近年來，人們逐步認識到部分神經退行性疾病與中樞神經系統銅穩態的失調控相關，如WD。

銅穩態失調與認知功能的關系已吸引更多研究者的注意。阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者腦中銅含量顯著升高，其銅穩態的失衡可能導致AD患者認知缺陷和其病理的加重。動物實驗研究發現，普通小鼠海馬注射Cu-Aβ1-42，可出現認知障礙，經過銅螯合劑治療之后，實驗小鼠的認知功能顯著改善；長期銅暴露不僅會加速AD小鼠認知功能下降，而且會使正常小鼠出現認知損傷。為了研究WD患者高銅水平對認知功能的影響，本實驗選用TX小鼠為實驗對象。本實驗行為學結果顯示，模型組小鼠的認知功能顯著低于正常組；模型加肝豆湯改良方組小鼠的認知功能顯著優于模型組。由此可見，中藥肝豆湯改良方可改善TX小鼠的認知功能。

突觸是神經細胞相接觸部分的功能特化區，也是多種學習形式的基礎，其功能紊亂可導致認知損害。Synaptophysin是一種特異性存在突觸囊泡膜上的糖蛋白，反映突觸分布與密度；Synapsin1是一種神經細胞特異的磷酸化蛋白，通過調節突觸前囊泡釋放和突觸傳遞來影響其突觸功能。作為興奮性突觸后密度的支架蛋白，PSD-93通過調節神經遞質的釋放，對突觸可塑性尤其是在短時程突觸可塑性的發生過程中起到關鍵作用；PSD-95在神經發育過程中涉及谷氨酸能傳遞，是突觸可塑性和樹突棘形態發生的重要組成部分。實驗結果顯示，與正常組比較，模型組海馬區Synapsin1、Synaptophysin、PSD-93、PSD-95的蛋白表達量顯著降低；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬區Synapsin1、Synaptophysin、PSD-93、PSD-95的蛋白表達水平顯著增加。因此，本實驗結果表明TX小鼠存在突觸功能障礙，中藥肝豆湯改良方可改善TX小鼠突觸功能。

8-OHdG是氧化應激或者含氧代謝過程中產生的羥基自由基，是氧化應激損傷的標志物。本實驗研究結果顯示，模型組海馬8-OHdG表達水平顯著高于正常組；模型加肝豆湯改良方組8-OHdG表達水平顯著低于模型組。這表明中藥肝豆湯改良方可降低銅沉積所誘導的氧化應激損傷。

腦內銅沉積可誘導氧化應激，激活PKR/eIF2α通路。活化后的PKR可誘導真核eIF2α發生磷酸化，減少蛋白轉運，p-eIF2α通過調控突觸可塑性，進而損傷患者的記憶功能。增加的P-eIF2α可以選擇性刺激ATF4的翻譯，促進凋亡分子CHOP的表達增加，誘導細胞凋亡，從而抑制突觸相關蛋白Synapsin1、 Synaptophysin、PSD-93、PSD-95表達，損傷突觸功能。本實驗結果顯示，模型組PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平較正常組顯著增加；模型加肝豆湯改良方組PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平較模型組顯著下調。TUNEL染色結果顯示，肝豆湯改良方可顯著降低TX小鼠海馬神經細胞凋亡。結果表明，高銅環境可激活PKR/eIF2α通路誘導突觸功能，而肝豆湯改良方可通過抑制PKR/eIF2α通路減輕高銅誘導突觸功能障礙，改善TX小鼠認知功能損傷。

綜合以上實驗結果，筆者認為，TX小鼠海馬內PKR/eIF2α通路被激活，誘導突觸功能障礙，損傷TX小鼠認知功能；中藥肝豆湯改良方可通過調控PKR/eIF2α通路，促進突觸相關蛋白表達，減輕高銅誘導的突觸功能障礙，改善TX小鼠認知功能損傷癥狀。