組織中P16、VEGF表達與結腸癌患者臨床分期的相關性

余倩倩，童慶紅

(潢川縣人民醫院 病理科，河南 信陽 465150)

手術是治療結腸癌的重要方式，早期患者可在手術治療后獲得長期生存，而對于中晚期或遠處轉移患者，也可通過術后化療延長生存期，挽救患者生命，但不同臨床分期患者治療方法不盡相同，且預后存在一定差異[1]。因此，尋求可有效評估結腸癌患者臨床分期的指標有重要意義。目前對于結腸癌臨床分期主要采取影像學診斷，但常規影像學診斷有一定滯后性，無法及時反映病灶變化，評估臨床分期的價值一般。生物學標志物是評估腫瘤臨床分期的重要方式，多腫瘤抑制基因P16是一種蛋白標志物，可抑制多種細胞周期蛋白/細胞周期依賴性蛋白酶復合物的激酶活性，從而抑制細胞生長，與腫瘤發展有關[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)屬于促血管生成因子，與腫瘤生長、浸潤及轉移密切相關[3]。由此推測組織中P16、VEGF表達可能與結腸癌患者臨床分期相關。鑒于此，本研究著重分析組織中P16、VEGF表達與結腸癌患者臨床分期的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年5月至2021年5月潢川縣人民醫院收治的80例結腸癌患者臨床資料。80例患者中男47例，女33例；年齡34～60歲，平均(46.60±2.37)歲；腫瘤直徑2～7 cm，平均(4.30±0.85)cm；病理類型腺癌64例，腺鱗癌16例。(1)納入標準：①結腸癌符合《中國結直腸癌預防共識意見》[4]中的診斷標準，并經術后病理診斷檢查確診；②術前未接受放化療；③在潢川縣人民醫院完成病理學檢查；④臨床資料完整。(2)排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②同期需行其他手術治療；③合并免疫功能障礙；④合并血液系統疾病。

1.2 結腸癌患者臨床分期評估及分組方法采用腫瘤(tumor node metastasis，TNM)[5]分期標準，0～Ⅰ期為原發腫瘤僅局限于黏膜內或黏膜下層，無淋巴結及遠處轉移；Ⅱ期為原發腫瘤侵犯腸壁肌層，無淋巴結轉移及遠處轉移；Ⅲ期為無論原發腫瘤侵犯深度，存在區域淋巴結轉移，無遠處轉移；Ⅳ期為腫瘤轉移至其他器官，腹腔種植轉移，遠處淋巴結轉移。將0～Ⅰ期患者資料納入早期組，將Ⅱ期、Ⅲ期患者資料納入中期組；將Ⅳ期患者資料納入晚期組。

1.3 組織中P16、VEGF檢查方法及陽性判定標準80例患者均在術中取腫瘤組織，常規甲醛固定，石蠟包埋，厚4 μm連續切片，石蠟切片脫水化后，用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)浸泡5 min，隨后組織抗原微波修復；加內源性過氧化物酶阻滯劑，室溫下孵育10 min，然后使用PBS沖洗3次，每次3 min；加封閉用正常山羊血清工作液，室溫下孵育20 min，滴加P16、VEGF 1抗，4 ℃冷藏過夜；PBS沖洗3次，每次3 min，加生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗，每次3 min，加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；加過氧化物酶顯色底物顯色劑，5～10 min，顯色完畢，使用蘇木素復染，鹽酸酒精分化10 s，碳酸鋰返藍10 s，脫水、透明、封片。P16、VEGF陽性標準：采用染色強度結合陽性細胞百分率的半定量積分法判定，P16陽性表達于細胞漿及細胞核，VEGF陽性表達于細胞核及細胞質，于高倍視野(×400)下隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，計算陽性細胞百分率，≤10%(0分)、>10%～25%(1分)、>25%～50%(2分)、>50%～100%(3分)；著色深淺評分，無顯色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)；兩類分數乘積<3分為陰性，否則為陽性。

2 結果

2.1 結腸癌患者臨床分期情況80例結腸癌患者中，0～Ⅰ期19例(23.75%)，Ⅱ期24例(30.00%)，Ⅲ期26例(32.50%)，Ⅳ期11例(13.75%)。

2.2 不同臨床分期結腸癌患者基線資料中/晚期組組織中P16陰性表達、VEGF陽性表達患者占比高于早期組，差異有統計學意義(P<0.05)；中期組、晚期組組織中P16、VEGF表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同臨床分期患者其他基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床分期結腸癌患者基線資料比較

2.3 組織中P16、VEGF表達與結腸癌患者臨床分期的相關性分析將結腸癌患者臨床分期作為因變量(“1”=中/晚期，“0”=早期)，并將表1中經比較差異有統計學意義的變量(組織中P16表達、組織中VEGF表達)納入作為自變量(賦值情況見表2)，進行logistic回歸分析，結果顯示，組織中P16陰性表達、VEGF陽性表達與結腸癌患者臨床高分期有關(OR>1，P<0.05)。見表3。

表2 變量賦值說明

表3 組織中P16、VEGF表達與結腸癌患者臨床分期的相關性分析

3 討論

以手術為主的綜合方案是目前治療結腸癌的重要手段，早期結腸癌患者經上述方案治療后生存率得到顯著提高，預后較好；但中晚期患者腫瘤侵犯淋巴結及周圍組織，在一定程度上增加治療難度，術后易復發，導致不良預后[6]。本研究結果顯示，80例結腸癌患者中，中晚期患者61例，占比76.25%。可見，結腸癌患者確診時往往為中晚期，因此，明確患者臨床分期對患者治療方案的擬定十分必要。

P16基因是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調控，可負調節細胞增殖及分裂，對抑制腫瘤生長有重要意義[7]。VEGF可通過與內皮細胞表面特異性受體相結合，參與調解腫瘤細胞的增殖，誘導血管生成，為腫瘤生長提供營養[8]。由此推測組織中P16、VEGF可能與結腸癌臨床分期相關。本研究結果顯示，中、晚期組組織中P16陰性表達、VEGF陽性表達患者占比高于早期組，并經logistic回歸分析，結果顯示，組織中P16陰性表達、VEGF陽性表達與結腸癌患者臨床分期密切相關，表明組織中P16陰性表達、VEGF陽性表達與結腸癌患者臨床高分期相關。分析其原因在于，P16基因是重要的抑癌基因，其編碼產物P16蛋白可通過與周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4)相結合，調控CDK4/周期蛋白的D復合產物的催化活性，進而抑制腫瘤細胞增殖，控制其惡性程度[9]。但當P16基因缺失或P16蛋白低表達，使細胞增殖程序失控，從而促進腫瘤細胞生長，同時缺失P16蛋白還可導致細胞間黏附力下降，使腫瘤更容易發生轉移，導致臨床分期升高。因此，組織中P16陰性表達與結腸癌患者臨床分期密切相關。腫瘤侵襲及轉移過程涉及多種因素，其中血管生成是重要因素。VEGF可通過與其特異性受體相結合，使受體自身磷酸化，激活細胞內信號傳導通路，促使血管內皮細胞增殖、分裂，誘導新生血管生成并增加血管通透性，為腫瘤生長及侵襲提供營養物質，從而導致結腸癌患者臨床分期升高[10]。

綜上所述，組織中P16陰性表達、VEGF陽性表達與結腸癌患者臨床高分期存在一定聯系，未來臨床可通過檢測患者組織中P16、VEGF表達情況，評估患者臨床分期。