超高效液相色譜法同時測定正柴胡飲顆粒中8個成分含量

明立亮，宋 勛，周思民

（1. 海南省萬寧市人民醫(yī)院 藥劑科，海南 萬寧 571500；2. 深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院，廣東 深圳 518000；3. 海南省人民醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 海口 570177）

正柴胡飲顆粒是由柴胡、陳皮、防風(fēng)、甘草、赤芍和生姜6種藥材組成的復(fù)方制劑，具有發(fā)散風(fēng)寒，解熱止痛的功效，用于外感風(fēng)寒所致的發(fā)熱惡寒、無汗、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽癢咳嗽、四肢酸痛；流感初起、輕度上呼吸道感染見上述證候者[1]。方中柴胡疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣，為君藥；防風(fēng)祛風(fēng)解表，勝濕止痛，生姜解表散寒，溫中止嘔，化痰止咳，共為臣藥；赤芍清熱涼血，散瘀止痛，陳皮理氣健脾，燥濕化痰，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。該制劑現(xiàn)收載于《中國藥典》2020年版一部，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對芍藥苷進行含量測定[1]，現(xiàn)有相關(guān)文獻也僅針對其中 1～2 個成分進行定量分析[2-5]，不足以全面評價其內(nèi)在質(zhì)量。本研究首次建立了一種快速、高效、經(jīng)濟的多成分含量測定方法，同時測定正柴胡飲顆粒中 8個有效成分的含量。8個成分分別為柴胡的有效成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d[6-7]、陳皮的有效成分橙皮苷[8]、防風(fēng)的有效成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷[9-10]、甘草的有效成分甘草苷和甘草酸銨[11]及赤芍有效成分芍藥苷[12]。該檢測方法具有速度快，效率高，溶劑消耗少，耐用性好，靈敏度高，穩(wěn)定可靠等優(yōu)點[13]，可為進一步提高正柴胡飲顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQuity UPLC（美國Water公司）；ABS-135S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；FP240型鼓風(fēng)干燥箱（德國Binder公司）；高效能超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-202044，純度：96.8 %），甘草苷（批號：111610-201607，純度：93.1 %），橙皮苷（批號：110721-202019，純度：95.3 %），升麻素苷（批號：111522-201913，純度：94.6 %），5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：111523-201811，純度：97.4 %），甘草酸銨 （批號：110731-202021，純度：96.2 %），柴胡皂苷a（批號：110777-201912，純度：94.8 %），柴胡皂苷d（批號：110778-201912，純度：96.3 %，中國食品藥品檢定研究院）；正柴胡飲顆粒6批，市售，批號：200215，200324，200219，200517，200632，200703；規(guī)格：3 g/袋；甲醇，乙腈均為液相色譜純（Merck）；乙醇（分析純，美國Fisher公司）；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific AcclaimTMRSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2 μm），流動相為乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，8 %A；5～10 min，8 %→15 %A； 10～15 min，15 %→30 %A；15～25 min，30 %→50 %A；25～30 min，50 %→60 %A；30～35 min，60 %→8 %A）；流速：0.2 ml/min；檢測波長：0～22 min，250 nm（檢測芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨），23～35 min，210 nm（檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d），柱溫：30 ℃；進樣量：2.0 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d適量，加70 %乙醇超聲溶解并定容，制成每1 ml分別含芍藥苷1428 μg、甘草苷106.1 μg、橙皮苷1728 μg、升麻素苷56.65 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷30.33 μg、甘草酸銨418.3 μg、柴胡皂苷a 72.25 μg和柴胡皂苷d 9.420 μg的混合對照品儲備液，室溫避光保存，備用。精密吸取混合對照品儲備液5 ml，置10 ml量瓶中，用70 %乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取正柴胡飲顆粒5袋混勻后，研細，精密稱定1.0 g，置錐形瓶中，加70 %乙醇30 ml，精密稱定，超聲處理30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），取出放冷后，用70 %乙醇補足損失的重量，搖勻，室溫避光保存。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下的供試品溶液、混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果色譜圖基線平穩(wěn)，8個成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰計均大于8100。色譜圖見圖1。

圖1 UPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品儲備液0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 ml，置10 ml量瓶中，加70 %乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）對峰面積（y）進行線性回歸，計算8個成分回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表1。

表1 8個成分的回歸方程及線性范圍

2.3.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖并計算8個成分峰面積的RSD。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積RSD（n=6）分別為0.48 %，0.69 %，0.85 %，0.96 %，1.02 %，0.67 %，0.89 %，0.74 %，表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（批號：200215）溶液，分別于0，2，6，10，16，24，36 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算8個成分峰面積RSD。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積RSD（n=7）分別為0.78 %，0.69 %，1.21 %，0.69 %，0.71 %，0.82 %，0.97 %，0.58 %，表明供試品溶液36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批供試品（批號：200215）均勻內(nèi)容物細粉6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖及峰面積，按外標(biāo)法計算8個成分含量及其RSD值。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d平均含量分別為10.25，0.7541，12.36，0.4125，0.2121，2.896，0.5226，0.0668 mg/g，RSD（n=6）分別為0.54 %，1.02 %，0.49 %，0.88 %，0.63 %，0.45 %，0.74 %，1.21 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量供試品（批號：200215）均勻內(nèi)容物細粉6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入混合對照品儲備液3.5 ml，按2.2.2項下方法處理，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算8個成分加樣回收率及相應(yīng)RSD值。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d平均加樣回收率分別為98.30 %，98.75 %，98.49 %，98.71 %，98.47 %，98.75 %，98.57 %，98.42 %；RSD（n=6）分別為0.6 %，0.6 %，0.8 %，1.0 %，0.7 %，1.1 %，0.8 %，0.5 %。見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

表2（續(xù)）

2.4 耐用性試驗

2.4.1 色譜柱考察 精密稱取樣品（批號：200215）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別采用色譜柱Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）柱 、Waters C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱、Thermo Scientific AcclaimTMRSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）柱，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算8個成分含量，芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的RSD（n=3）分別為0.57 %，0.63 %，0.95 %，0.77 %，0.57 %，0.39 %，0.43 %，0.82 %。結(jié)果表明，3種色譜柱均能滿足試驗要求。

2.4.2 流速考察 精密稱取樣品（批號：200215）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，流速分別設(shè)置為0.8，1.0，1.2 ml/min，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算8個成分的含量。芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的RSD（n=3）分別為0.74 %，0.65 %，0.81 %，0.34 %，0.72 %，0.29 %，0.55 %，0.66 %，結(jié)果表明流速發(fā)生一定程度變化時，仍能滿足試驗要求。

2.4.3 柱溫考察 精密稱取樣品（批號：200215）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液， 柱溫分別設(shè)置為 20，25，、30 ℃ ，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算8個成分的含量。芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的RSD（n=3）分別為0.35 %，0.28 %，0.65 %，0.74 %，0.55 %，0.38 %，0.47 %，0.89 %，結(jié)果表明柱溫發(fā)生一定程度變化時，仍能滿足試驗要求。

綜上，本文建立的UPLC方法耐用性良好。

2.5 樣品測定

取6批供試品，按2.2.2項下方法處理，按2.1項下色譜條件平行進樣3次，記錄色譜圖及相應(yīng)峰面積，按外標(biāo)一點法計算8個成分含量，結(jié)果見表3。

表3 8個成分含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 流動相的選擇

考察分別以乙腈、甲醇作為有機相，以不同濃度的磷酸（0.5 %，0.2 %，0.1 %）和甲酸（0.5 %，0.2 %，0.1 %）作為水相的分離效果，結(jié)果乙腈-0.1 %磷酸水溶液梯度洗脫時分離效果最佳，基線平穩(wěn)，保留時間適中，各待測組分色譜峰峰型較好。

3.2 檢測波長的選擇

在190～400 nm波長段分別掃描8個成分對照品溶液，結(jié)果芍藥苷在230 nm波長處有較大吸收，甘草苷最大吸收波長為237 nm，甘草酸銨最大吸收波長為251 nm，橙皮苷最大吸收波長為284 nm，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在254 nm波長處有最大吸收峰，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在210 nm波長處有最大吸收峰，預(yù)實驗結(jié)果表明采用不同時段波長切換法進行檢測，因過于頻繁的切換波長，基線發(fā)生漂移，造成基線不穩(wěn)定。最終確定0～22 min在250 nm波長處檢測芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨6個成分，23～35 min在210 nm波長處檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 2個成分的含量。

3.3 樣品提取方法的考察

預(yù)實驗考察了超聲和加熱回流兩種提取方式，結(jié)果顯示超聲提取較加熱回流提取各待測成分響應(yīng)值無明顯差異，但超聲提取較加熱回流操作簡便，提取時間短，故最終選擇超聲法對樣品進行處理。考察了不同濃度的甲醇、乙醇溶液的提取效果，結(jié)果顯示以70 %乙醇為溶劑提取時各成分提取率最高，且雜質(zhì)干擾少，色譜峰峰形良好。進一步考察不同提取時間（20，30，40 min）對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)30 min 時各成分已基本提取完全。最終確定，最優(yōu)提取方法為70 %乙醇超聲提取30 min。

4 結(jié)論

本文建立UPLC法同時測定正柴胡飲顆粒中芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 8個成分含量，方法簡便高效，快速準(zhǔn)確，可作為正柴胡飲顆粒質(zhì)量評價的有效方法。