前列腺纖維性增生的差異表達基因篩選及富集研究*

萬少平，蔡季，肖靚琨

（1.岳陽市人民醫院泌尿外科，湖南岳陽 414000；2.織金縣人民醫院泌尿外科，貴州織金 552100；3.岳陽市人民醫院外科，湖南岳陽 414000）

良性前列腺增生是引起中老年男性排尿障礙最常見的良性疾病之一[1]，隨著年齡增長，少數患者會出現尿潴留[1-3]。臨床經尿道前列腺電切治療男性下尿路癥狀和尿潴留時，發現大多數患者良性前列腺增生是尿道周圍腺體的擴大增生，導致排尿困難；顯微鏡下觀察電切前列腺組織，前列腺增生多呈結節性改變，以不同比例間質和腺上皮構成；少數排尿困難的患者，前列腺擴大增生不明顯，術中發現前列腺稍增大，甚至變小，呈纖維性收縮，電切組織顯微鏡下觀察組織間質以膠原纖維增生為主，僅見少量增生腺體[4-8]。本研究通過差異基因（differentially expressed genes, DEGs）比較的方法，認識纖維性增生的致病基因，不僅可以深入認識其病理發生的分子本質，為良性前列腺纖維性增生提供基因診斷方法，而且可以指導該類型前列腺增生的治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年2月—2019年12月岳陽市人民醫院和織金縣人民醫院收治的前列腺增生患者14 例，年齡60～91 歲。所有患者出現尿潴留，前列腺特異性抗原＜4 ng/L。入院后行前列腺等離子電切手術治療，病理診斷為良性前列腺增生，其中纖維性增生7 例（纖維組），結節性增生7 例（結節組）。

所有標本在手術切除后，用生理鹽水沖洗3 次，去除血跡，30 min 內放入液氮速凍，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司），Agilent 2100 bioanalyzer（美國Agilent Technologies 公司），六堿基隨機引物（深圳華大基因公司），QiaQuick PCR 試劑盒（美國Qiagen 公司），qPCR TaqMan Probe（美國Yeasen 公司）。NanoDrop 分光光度計和Qubit 熒光計（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取總RNA標本送深圳華大基因公司，按照Trizol RNA 提取試劑盒說明書進行操作，提取結節性前列腺增生組織及纖維性前列腺增生組織RNA。采用Nanodrop 檢測RNA 的純度（260～280 mm光波處的OD 值），瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 程度以及是否被污染，Qubit 定量檢驗RNA 濃度；Agilent 2100 檢測RNA 的完整性。

1.3.2 文庫制備檢測總RNA 樣本合格后，采用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，將mRNA 打斷成短片段模板，用六堿基隨機引物合成cDNA 鏈。cDNA 鏈經過QiaQuick PCR 試劑盒純化，洗脫，末端修復，連接測序接頭，瓊脂糖凝膠電泳，PCR 擴增富集cDNA，完成文庫制備。

1.3.3 測序文庫構建完成后，Qubit 2.0 初步定量，Agilent 2100 檢測文庫的Insert size，qPCR TaqMan Probe 準確定量文庫的有效濃度（＞2 nm）。合格后，通過MGIseq-2000測序平臺進行PE150測序。

1.4 統計學方法

測序數據采用SOAPnuke（v1.5.2）過濾，過濾后的數據采用Bowtie2（v2.2.5）進行比對，基因相對表達量用RSEM（v1.2.12）計算，用DESeq2（v1.4.5）進行差異基因分析，將校正后的P＜0.05，且差異倍數≥2作為篩選標準。將差異表達基因進行GO 富集分析，用DAVID 工具分析KEGG 信號通路富集情況。

2 結果

2.1 差異基因相對表達量分析

對比兩組后發現差異表達基因1 598 個；相較于結節組，纖維組有1 063 個基因相對表達量上調，535 個基因相對表達量下調。見圖1。

圖1 差異基因相對表達量的火山圖

2.2 差異基因的GO富集分析

GO 富集分析將DEGs 分為3 類：生物學過程、分子功能、細胞組分。在生物學過程中，DGEs 主要富集在離子轉運、細胞黏附、細胞外基質等生物學過程中（見圖2）。在分子功能中，DGEs 主要富集在近端啟動子DNA 結合轉錄激活劑、RNA 聚合酶Ⅱ、DNA 結合轉錄激活劑、信號受體結合等活性分子功能上（見圖3）。在細胞組分中，DGEs主要富集在細胞膜、細胞外區域、質膜等細胞部位（見圖4）。

圖2 GO富集分析中生物過程組氣泡圖

圖3 GO富集分析中細胞組分組氣泡圖

圖4 GO富集分析中分子功能組氣泡圖

2.3 差異基因的KEGG通路分析

通過DAVID 工具對DEGs 進行KEGG 信號通路分析后發現，DEGs 主要富集在細胞外基質—受體、細胞因子與細胞因子受體等信號通路上（見圖5）。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

2.4 差異基因PPI互作網絡分析

將兩組樣本DEGs 所編碼的蛋白質利用String數據庫進行PPI 網絡互作，預測DEGs 間相互作用，選取PPI 網絡中連通度排序前10 位為核心基因并排序。結果為FOS、GNG13、CXCR4、CCL2、OPRM1、PPBP、GAL、OPRK1、JUN、EGR1。對纖維性增生組而言，PPBP、OPRM1、GAL為上調，其余基因均為下調。這些關鍵基因的關系見圖6。

圖6 前列腺纖維性與結節性增生關鍵差異基因的聯系

3 討論

臨床良性前列腺結節性增生非常常見，良性前列腺纖維性增生相對較少，本研究從兩類患者的基因水平發現其不同，為其發生、發展的作用機制及治療提供新思路。本研究共發現1 598 個差異表達基因，與結節性增生組織相比，纖維性增生組織中相對表達量上調基因1 063 個，相對表達量下調基因535 個。對這些基因進行GO 富集分析后發現，DGEs 主要富集在離子轉運、細胞黏附、細胞外基質組生物學過程，和富集在近端啟動子DNA 結合轉錄激活劑、RNA 聚合酶Ⅱ，信號受體結合等活性分子功能中。KEGG 富集通路分析發現，DEGs 主要富集在細胞外基質—受體相互作用、細胞因子與細胞因子受體相互作用等信號通路上。細胞外基質是由動物細胞合成，并分泌到胞外，分布在細胞表面和細胞之間，是多糖、蛋白質或蛋白聚糖等物質。這些物質不屬于任何細胞，但可為細胞生存提供重要的結構支架和組織連接，并通過信號轉導系統影響細胞的形態、增殖、分化、遷移、代謝和功能等[9]。

從PPI 互作網絡分析可以發現，與纖維性前列腺增生相關的最主要3 個基因為PPBP、OPRM1、GAL。PPBP基因編碼的蛋白質是血小板衍生的生長因子，屬于趨化因子家族，是中性粒細胞的有效化學吸引劑和活化劑，該蛋白具有殺菌和抗真菌作用，是抗微生物的蛋白質[10-11]。GAL編碼的蛋白質在泌尿生殖道廣泛表達神經內分泌肽——甘丙肽及其相關肽，其已被證明具有抗真菌活性，并被認為是先天免疫系統的一部分[12-13]。本研究篩選出的PPBP和GAL基因，均可以表達抗菌活性物質，提示前列腺纖維性增生的發生、發展可能與微生物感染有關，至于微生物是細菌或真菌，還未明確。

OPRM1基因位于人類第6 號染色體6q24～q25位置上，長度96.31 kB，包括轉錄調控區、3 個內含子和4 個外顯子。OPRM1通過神經活性配體-受體相關作用，調節雌激素信號通路來調節前列腺的增生[14-16]，OPRM1和上述GAL基因對細胞的增殖為負調控，需要證實的是該負調控可能在前列腺纖維增生過程中的作用機制。

本研究篩選出了3 個與纖維性增生相關的核心差異表達基因，以及若干相關的富集生物位點和生物通路，為臨床監測和治療前列腺纖維性增生提供潛在的生物標志物及靶點。但是本研究病例數不夠，可能存在一些偏倚，此外需要進一步完善分子生物學實驗來確認這些基因的具體功能。