關節軟骨損傷修復研究展望

敖英芳 代文立

關節軟骨損傷是全世界性多發常見的健康問題之一。由于關節軟骨缺乏血運，創傷性軟骨損傷所造成的局部軟骨缺損通常是由新的纖維軟骨組織來進行填充。與透明軟骨相比，纖維軟骨機械強度明顯較弱，并且會隨著時間的推移而逐漸退化，導致結構和功能的喪失，并逐漸發展為骨性關節炎，最終導致進行性全關節破壞。目前臨床上對于創傷性軟骨損傷局部缺損尚無治愈方法，有學者建議對其進行早期外科手術，例如進行微骨折手術或自體骨軟骨移植手術，以盡可能恢復關節軟骨覆蓋、促進愈合，最大程度地減少關節的退化[1]。通常，這些外科手術方法僅能有限地進行組織再生，短期緩解癥狀。近年來，新興的組織工程技術因可以有效地促進組織修復再生而備受關注。本文中，我們對目前臨床上常用的軟骨損傷修復方法、處于臨床前研究及基礎研究的修復方法進行討論，并展望關節軟骨損傷修復的臨床前景與發展方向。

一、微骨折技術

微骨折技術通過開放軟骨下骨，從而在軟骨缺損和下方的骨髓之間形成通道。目前，臨床與研究上普遍認為，通過這些通道將多能性骨髓間充質干細胞釋放募集到缺損部位以修復關節軟骨。這項技術由于其簡單快捷性和低成本在臨床經常使用。然而，這種方法僅對小的缺損有效，修復后形成不了透明關節軟骨，術后僅能提供相對的功能改善，其臨床作用與意義相對有限。

二、骨軟骨移植技術

自體骨軟骨移植手術也應用于臨床，是在關節非負重區域軟骨面上取出圓柱形骨軟骨組織植入到負重區軟骨缺損處。盡管有文獻報道通過自體骨軟骨移植得到較好的臨床效果，但結果會因年齡，性別和病變大小而有很大不同。同時供體部位損傷與不適以及局部供體組織的可用性有限，使得自體骨軟骨移植僅適用于某些中、小尺寸的軟骨缺損。同時移植骨軟骨之間的軟骨修復愈合，移植軟骨與受區周邊軟骨的愈合都存在問題，另有供區損傷帶來的創面開放，出血炎性因子釋放等對關節內微環境、內穩態等帶來的不利影響使其應用受到限制并逐漸趨少。同種異體骨軟骨移植盡管沒有供區損傷以及移植物大小不足的問題，但存在同種異體移植物的保存、組織的可用性、受者免疫反應等問題，同時供體來源不足以及質量等又是臨床應用的實際問題。

三、自體軟骨細胞移植技術(autologous chondrocyte implantation,ACI)

ACI技術能夠適應軟骨缺損的輪廓，使其對于治療大面積(> 3～4 cm2)軟骨損傷具有很強的臨床吸引力。ACI需要進行兩次手術：第一次手術時需從健康的關節非負重區軟骨中取材軟骨組織，在體外培養擴增軟骨細胞，然后進行第二次手術將培養擴增的軟骨細胞植入軟骨缺損部位進行修復。這項技術的更新版是在植入前將軟骨細胞播種到支架上，稱為基質誘導ACI(matrix-induced ACI,MACI)。據報道，接受MACI治療的病人膝關節功能可較長期改善，滿意度也較高[2]，但是也需要體外培養擴增軟骨細胞和兩次手術才能完成。該方法最初在國際上臨床應用研究較多，但因其局限性，目前在臨床應用上也受到限制，不如僅需要一次手術的修復方法對臨床醫生更具吸引力。

四、自體基質誘導軟骨形成技術(autologous matrix-induced chondrogenesis,AMIC)

相對于需要兩次手術的ACI，AMIC可以在單次手術中完成。為了進行AMIC，手術醫生需要暴露并清理缺損部位，然后做微骨折釋放骨髓中的間充質干細胞(MSC)，最后將Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白混合制作的生物膜縫合或粘合到軟骨缺損區。膠原蛋白基質被認為可以穩定血凝塊，有助于促進早期的機械穩定和軟骨再生。研究發現，AMIC在治療全層軟骨缺損方面安全有效[3]。在一項長達5年隨訪的研究中，進行AMIC的病人在Tegner，Lysholm，ICRS和Cincinatti評分方面均有顯著改善[3]。此外，MRI顯示所有軟骨缺損有中度到完全填充。我們牽頭進行了相關的多中心總計120例的隨機對照臨床研究，通過使用AMIC對軟骨損傷病人進行修復，取得了很好的近期療效。然而，由于總體研究存在病例較少，隨訪時間短等的問題，最終臨床效果尚需更高質量的臨床研究來進一步驗證。

五、組織工程修復方法

1.組織工程支架：目前認為，良好的組織工程支架是可以仿生天然組織的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)功能特性，可以促進細胞的封裝，并支持細胞增殖和ECM生成的生物材料。當不使用支架時，鄰近正常的軟骨將由于缺乏植入物而影響愈合。為此，生物材料應該由在結構和功能上與天然關節軟骨相似，并且是由在生物學上相容的材料組成。為了代替天然關節軟骨ECM，支架應能夠：(1)產生高度水合的環境，以便交換養分，電解質，氧，代謝廢物，以及影響細胞活力、分化和功能的小分子介質；(2)抵抗徑向和縱向變形并吸收壓縮載荷；(3)建立緊密的細胞-基質接觸，以保持細胞的活力、分化能力和功能；(4)與相鄰的軟骨組織無縫融合，并黏附于軟骨下骨。

目前已經研究了多種合成或天然材料，其中天然材料包括藻酸鹽，明膠，瓊脂糖，透明質酸，纖維蛋白以及膠原蛋白等。而合成材料更多樣化，通常包括聚ε-己內酯，聚1-乳酸，聚乳酸-乙醇酸，聚乙烯醇，聚乙二醇，聚氨酯和自組裝肽等。天然聚合物具有良好的生物可降解性以及生物相容性，但其組成因批次而異。合成材料更易于復制，其性質可以精確控制。其中，基于聚己內酯和自組裝肽的支架在體外能維持軟骨細胞的增殖和分化。然而，相對于合成材料，天然材料正被更多地用于臨床研究中。其中，由我們團隊研發的脫鈣皮質骨支架已經在動物軟骨缺損模型中成功實現了軟骨修復，并且通過將脫鈣皮質骨支架與殼聚糖水凝膠相結合，或是將其與MSC特異性親和肽相結合[4]，均顯示出了優異的軟骨修復能力。而在人體內，脫鈣皮質骨支架應用5～7年的隨訪臨床效果良好。目前，該支架已實現成果轉化，正在開展多中心臨床研究并顯現出非常好的臨床應用前景。

盡管組織工程支架提供了許多優勢，但使用支架還可能出現與降解相關的毒性，應力屏蔽，細胞表型改變和重塑障礙等問題，這些問題為研究無支架技術提供了動力。無支架的自組裝過程能促進細胞間相互作用，囊括了軟骨發育的相關條件，并可以導致硫酸軟骨素6與硫酸軟骨素4的比率發生變化，以及Ⅵ型膠原蛋白向Ⅱ型膠原蛋白發生轉化。通過使用生物化學和生物力學刺激，使用無支架方法制造的工程軟骨可以獲得與天然軟骨組織相當的功能特性。例如，無支架的工程軟骨的壓縮模量和拉伸模量可以分別達到-0.32 MPa和-8 MPa，分別在天然軟骨的壓縮(0.1～2.0 MPa)和拉伸(5～25 MPa)模量的范圍內[5]。另外，無支架方法有可能規避與支架相關的缺點并生產具有生物力學功能的植入物。

組織工程支架的進展也集中于對天然組織結構的模擬上。例如，衍生自聚乙二醇和硫酸軟骨素的剛度梯度水凝膠可以產生具有剛度依賴性糖胺聚糖梯度的結構，該結構模仿了關節軟骨淺表層和深層區域之間的糖胺聚糖梯度[6]。在另一項研究中，具有多孔層的雙層聚ε-己內酯支架可以促使工程軟骨的帶狀排列的形成[7]。這些研究表明，實現軟骨的各向異性特性對于組織工程軟骨模擬天然軟骨的功能特性是很重要的。

作為個性化醫學領域的一項革命性技術，3D生物打印可以按照需求逐層沉積生物材料，從而使3D構建體適應特定病變形狀。目前已經有多種不同的打印策略用于軟骨組織工程：噴墨打印，激光輔助打印和生物擠出打印。噴墨生物打印是基于通過熱法或壓電法將液滴直接沉積到載體上的方法。激光輔助生物打印是在激光能源的影響下，將特定材料上的液滴沉積到接收載體上的方法。生物擠出打印是通過打印針直接將生物墨水沉積在載體上的技術。在這三種技術中，已經有研究者通過生物擠出技術，將天然材料(明膠，殼聚糖，藻酸鹽，透明質酸)或人工合成材料(PGA，PCL，PEG)和細胞混合進行打印。由于生物擠出技術允許打印具有高細胞密度的生物支架，使其成為構建全層軟骨組織的優良候選者。同時，它允許在生物墨水的不同層次中沉積不同的生物材料和細胞類型，以更好地模仿天然骨軟骨組織中不同的組織層次。其中，我們團隊通過3D打印技術開發出一種新型絲素蛋白-明膠復合支架，通過調節絲素蛋白和明膠的比例以平衡支架的機械性能和降解速率，并將支架與BMSC特異性親和肽相結合。這種雙重優化的支架在膝關節軟骨修復中表現出卓越的修復性能，因為它不僅保留了足夠的干細胞，而且還充當了血凝塊的物理屏障，并在新軟骨形成之前提供了機械保護。該支架已經成功在動物實驗中構建出了透明軟骨樣組織[8]。

在使用擠出法的3D生物打印時，生物墨水的生物相容性和可打印性是兩項關鍵的特性，而打印的穩定性和機械性能也是重要考慮因素。為了確保3D構建物的穩定，可以通過溫度變化，光交聯或化學交聯來固化打印后的構建體。另一種打印的方法是打印異質性支架，該支架由PCL支架和包含細胞的水凝膠組成[9]。生物擠出技術的優勢在于能夠直接打印生物墨水和細胞，同時生產功能化的構建體。通常通過評估打印細胞的活力來評估墨水的生物相容性。在比較不同的生物墨水的可打印性時，剪切應力和黏度是重要的參考因素。剪切應力會受到不同的打印參數的影響，例如針的幾何形狀和直徑。通常這些參數需要進行微調，以提高最終的3D構建物中的細胞活力和分化潛能。

2.種子細胞：工程軟骨植入物的理想細胞來源應該是易于分離和擴增的細胞，并且可以形成并維持軟骨相關表型，合成豐富的透明軟骨ECM，而且不會引起免疫學反應。在這方面，來自病人的關節軟骨細胞似乎是首選。在1990年代，Brittberg等從膝關節損傷病人中分離出關節軟骨細胞，并將這些軟骨細胞植入培養基中生長，然后將其植入病人中。但是，在關節鏡下觀察到其對鄰近正常軟骨的整合不良。與該技術相關的其他問題包括供體部位有限，體外細胞擴增的需求較高，以及修復部位移植物的過度生長[10]。

來自不同來源的MSC，例如骨髓，脂肪組織，滑膜，臍帶血，外周血等，被用于治療關節軟骨缺損。這些細胞具有易獲得性、良好的分化和增殖潛力、以及抗炎和免疫調節特性。不同來源的MSC分化成軟骨細胞的能力各不相同，其中滑膜來源的MSC表現出最大的分化成關節軟骨細胞的潛力[11]。但是，MSC的移植可能會產生軟骨和纖維組織的混合物，并且從長遠來看這可能會導致修復的失敗。因此，在將MSC成功用于軟骨修復之前，需要進一步研究其分化的方案。

胚胎干細胞(ESC)具有增殖和分化成幾乎任何類型的體細胞的潛力。將ESC轉化為軟骨細胞的各種方法包括與軟骨細胞共培養，以及先從ESC產生類似于MSC的細胞，然后利用多種生長因子將其分化為軟骨細胞。利用ESC進行軟骨再生的缺點包括倫理學上的擔憂，即人類胚胎的破壞，宿主的免疫排斥，以及畸胎瘤形成的風險。

誘導多能干細胞(iPSC)代表了一種相對較新的干細胞來源，具有與ESC相似的自我更新和多能能力，但沒有相關的道德和免疫原性問題。從人iPSC(hiPSC)生成軟骨細胞的策略目前正在開發和完善中。在目前應用于iPSC的各種誘導軟骨分化的方法中，最有前途的是模仿自然發展，將iPSC的單層培養首先分化為中胚層，然后進一步分化為軟骨培養[12]。然而，盡管hiPSCs在臨床上首次用于治療黃斑變性已引起關注，但當使用其用于軟骨分化時，新形成的軟骨的純度和均質性仍然存在差異，并且來自hiPSCs的軟骨細胞的體內移植仍然會有腫瘤形成的風險。

3.生物力學及生物化學刺激：研究表明，生物力學刺激對于軟骨穩態的維持具有重要作用。目前生物力學已經用于改善工程軟骨的性能。與未受刺激的新生軟骨相比，將軸向壓縮應用于軟骨細胞以后可以使其瞬時模量提高92%[13]。另外，也有研究發現，張力也具有改善新生軟骨生物力學特性的作用。用張力刺激，軟骨素酶ABC，TGFβ1和LOXL2同時處理自組裝軟骨后，其拉伸模量和強度可以提高大約6倍[14]。通過壓縮和剪切應力相結合，可以導致軟骨細胞產生的Ⅱ型膠原蛋白明顯增加[15]。同時研究也表明，機械應力可以影響軟骨的分解代謝和合成代謝，新合成的基質會因為機械應力而產生結構的重塑[16]。承受循環單向壓縮載荷的軟骨組織可以瞬時增加MMP-3和MMP-13的表達，并在刺激后2小時出現分解代謝變化，其特征是蛋白聚糖和膠原蛋白釋放到了培養基中。但是刺激12小時后，會出現合成代謝變化，具體表現為Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖表達增加，提示循環負荷具有重塑軟骨的作用[17]。這些研究的結果表明，生物力學刺激在工程化軟骨組織的形成中具有重要作用。了解軟骨在天然條件下的生物力學環境，以及其對體內和體外軟骨組織的影響，對于實現工程軟骨的臨床轉化非常重要。

在眾多生物化學刺激因子中，生長因子一直被認為是軟骨形成的重要調節因素。已經證明，TGF-β家族的成員在軟骨發育中起重要作用。它們通常被用于誘導MSC向軟骨細胞分化，增加軟骨ECM的合成，以及增強軟骨細胞的增殖。多項研究表明，TGF-β亞型在各種細胞類型上的作用不同，其中TGF-β1負責介導MSC之間的相互作用，TGF-β2介導MSC的肥大性分化，而TGF-β3具有較強的促進MSC分化的作用。另一個生長因子IGF-1以合成代謝的方式起作用，并可以增加蛋白聚糖和II型膠原的合成。FGF-2是一種參與傷口愈合的促細胞分裂因子，已被用于維持軟骨細胞的表型，增加軟骨細胞增殖以及軟骨的ECM沉積。BMPs影響軟骨形成和成骨，因為它們可以協助植入部位的骨軟骨整合，因此對于修復骨軟骨缺損具有吸引力。其中，BMP-2可以增加TIMP-1，Sox 9，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的表達，而BMP-7可以刺激富含蛋白多糖的ECM的產生。此外，BMP-2和BMP-7在ECM產生方面具有協同作用。除了上述多種生長因子外，研究人員也研發了多種小分子藥物以促進骨軟骨修復，例如kartogenin(KGN),aptamer,Y-27632等[18]。其中由我們團隊開發出可特異性募集軟骨細胞歸巢的多肽(CAP,DWRVIIPPRPSA)，以及促進MSC歸巢的多肽(E7、L7)，通過將其與脫鈣皮質骨、絲素蛋白等天然支架相結合，可以顯著增加軟骨損傷處相應細胞的募集，并在軟骨再生修復中表現出了明顯的促進作用[19]。除了我們團隊以外，已經有其他研究團隊成功使用了E7結合外泌體來促進關節腔內的滑液MSC向軟骨細胞分化[20]。

近年來，外泌體在骨性關節炎發展中的重要性已逐漸受到關注，而其在軟骨修復和骨性關節炎治療中的價值也逐漸被揭示。作為是MSC的關鍵分泌產物之一，外泌體可以產生類似于親代MSC的作用，并已經用作各種疾病模型的治療劑。近年來，已經有大量研究報道來自不同類型MSC的外泌體可以對軟骨損傷產生確切的治療作用。另外，Liu等[21]通過qRT-PCR分析證實了MSC和MSC外泌體中的lncRNA KLF3-AS1可能是具有治療作用的關鍵分子。在他們的研究中，用敲低lncRNA KLF3-AS1表達的外泌體處理大鼠軟骨細胞可以逆轉外泌體對軟骨保護作用，同時，沒有lncRNA KLF3-AS1表達的外泌體也可以加劇大鼠膝關節的軟骨損傷。這些數據表明，外泌體對骨性關節炎的治療作用可能與lncRNA KLF3-AS1有關。有趣的是，水凝膠材料已被證明具有良好的外泌體保留和持續釋放的功能。Schneider等[22]發現封裝在PEG水凝膠中的軟骨細胞可以分泌許多存在于外泌體中的蛋白質，他們認為，較小的外泌體在水凝膠中具有更好的擴散能力。Liu等[23]利用光誘導的亞胺交聯水凝膠作為外泌體支架來制備用于軟骨再生的脫細胞組織片，他們發現，大多數封裝的外泌體在PBS中浸泡14天后仍然保留在水凝膠內部。由于不同MSC來源的外泌體成分有所差異，在進行軟骨修復時，選擇何種MSC來源的外泌體仍存在爭議。基于此，我們團隊通過對比骨髓、滑膜、以及脂肪MSC來源的外泌體，發現脂肪MSC來源的外泌體在體外可以更好地刺激BMSC的遷移，增殖，軟骨形成和成骨分化，并且可以在小鼠模型中更好地促進軟骨和骨的再生[24]。

六、總結與展望

由于關節軟骨缺乏自我修復能力，關節軟骨損傷是目前臨床上最具挑戰性的關節傷病之一。目前，外科修復技術尚難以阻止其骨關節炎的發生與進展，從而加速了組織工程與生物治療技術的發展。在過去的二十年中，已經研用了許多不同類型的用于軟骨組織工程的生物支架。這些支架與不同來源的細胞相互組合，以促進損傷修復區新的軟骨組織再生。盡管研究者做出了巨大的努力，致力于制造模仿ECM的支架，并且在細胞培養后提供了模擬天然軟骨的生物力學、生物化學刺激，但到目前為止，這些方法中只有很少數達到了臨床試驗階段。主要挑戰在于制造合適的支架，這些支架能夠在植入后承受施加于負重關節的負荷，在降解后可以形成連貫成熟的新生軟骨，并能與周邊天然軟骨進行良好的整合。合適的種子細胞來源尚待確定，盡管直接使用軟骨細胞似乎是解決方案，但在大多數情況下，軟骨細胞在增殖時去分化是不可避免的。由于具有高生存力，招募手術的侵入性較小，以及較高的分化潛力，干細胞成為最常見的種子細胞來源。同時，將關節腔整體作為生物反應發生器和再生組織培育的微環境，通過骨髓刺激技術釋放自體干細胞，利用脫細胞基質或生物3D打印獲得的良好仿生生物膜修復軟骨損傷區域的自體、原位、一次手術修復技術更具有良好的研究與臨床應用前景。此外，帶有活細胞的生物 3D打印技術應用到臨床手術臺上直接修復關節軟骨損傷更為人們所期待。