組織工程技術促進骨腱界面有序再生的應用展望

劉俊 趙鑫 陳貝 石新 李煕瑩 曹焱鵬 陳耀武 呂紅斌

骨腱界面(bone-tendon interface,BTI)是存在于肌腱和骨之間的錨定結構，根據其組成結構的不同可分為纖維性BTI和纖維軟骨性BTI。纖維軟骨性骨腱界面包括肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨及骨這四層相互延續的結構。骨腱界面的組織成分、細胞排列和力學性能具有梯度漸變的特點，有利于應力在軟硬界面(肌腱和骨)之間的傳導[1]。相對于骨和肌腱的愈合，骨腱界面的損傷修復更加緩慢，組織學染色發現骨腱損傷處的基質成分和組織結構紊亂，且常伴有瘢痕組織增生[2]。損傷的骨腱界面無法快速完全地恢復至損傷前的正常層次結構，其生物力學性能較差，這將直接影響病人運動功能的恢復[1]。因此，如何促進骨腱界面損傷后快速而優質的愈合及其功能的恢復是運動醫學領域亟待解決的難題。

一、骨腱界面組織結構和成分的梯度漸變特征

骨腱界面的功能取決于其結構的完整性，大量的研究從宏觀和微觀角度對骨腱界面的力學環境進行了解析：肌腱纖維、細胞排列、礦化分布、基質成分等骨腱界面組織在應力傳導方向上呈現出梯度演變的結構特點，這一結構特征有利于提高應力在軟、硬界面中的傳導效率[1,3]。利用同步輻射技術對骨腱界面的化學成分進行解析發現，在骨腱界面纖維軟骨層中富含蛋白多糖以及鈣、鋅等微量元素，這些基質成分的含量及分布也同樣呈現出梯度漸變的特點[4]。

有研究證實，損傷狀態下梯度漸變的組織結構的破壞是骨腱界面損傷的主要組織病理特征。在骨腱界面損傷修復的過程中，瘢痕組織占據了大量的組織再生空間，原來的四層結構難以有序恢復至損傷前水平[2]。另外，損傷后的骨腱界面中各種膠原、蛋白成分及金屬元素都有不同程度的丟失，并且在損傷區域內排列紊亂、極性缺失，應力的傳導方向也各不相同[2,5]。

二、實現骨腱界面損傷有序再生的新要求

骨腱界面的組織結構包括力學性能完全不同的生物組織：肌腱、軟骨和骨，當外界應力施加于以上具有不同力學性能的組織時，它們將出現不均勻的形變，這會引起界面處的應力集中，進而增加骨腱連接部位撕裂或術后再撕裂的風險[1]。實現骨腱界面有序再生的重點即在于促進骨腱界面中骨、軟骨、肌腱的再生，在2017年美國國立衛生院舉辦的肌腱韌帶專題會議上，領域權威著重討論了骨腱界面損傷修復的新策略，明確指出實現骨腱界面損傷后的原位修復極具挑戰，促進骨腱界面損傷區域的骨、軟骨、肌腱的有序再生是治療骨腱相關疾病的重要出路[5]。目前的觀點認為，激發損傷區骨、軟骨、肌腱的修復潛能，恢復損傷區域骨腱界面原有的組織結構和基質成分的梯度漸變特征，是重建骨腱功能的最理想方案[6]。

三、組織工程技術促進骨腱界面有序再生的應用策略

組織工程技術在骨腱界面的研究中的應用前景廣闊。鑒于恢復梯度漸變的組織結構是促進骨腱界面有序再生的重要目標，目前的組織工程實踐側重于模擬天然骨腱界面的微觀結構以及復雜的細胞及其生存微環境[7]。我們可以針對材料進行優化設計和修飾，來部分實現正常骨腱界面梯度結構的仿生。此外，再生微環境中內源性干細胞方面的最新研究進展也給我們設計骨腱界面損傷后組織的原位有序再生策略提供了新的種子細胞來源[5]。

為了實現骨腱界面中骨、軟骨和肌腱的有序再生的目標，我們應該更加地關注支架材料、種子細胞和細胞因子三者的協同作用，其遠期的應用發展主要集中于：材料的仿生設計、種子細胞優化和生長因子控釋這三個方向[7]。

1.支架材料的仿生設計:支架的構建一直是廣大學者們關注的重點。一方面，我們需要材料來模擬正常骨腱界面的結構特征，實現形態和力學性能的梯度漸變仿生。另一方面，支架材料應具有良好的生物相容性，尤其應該具備優越的性能-細胞交互性，能夠促進內源性修復細胞定向分化并分泌特定的細胞外基質，從而形成梯度漸變的組織結構，實現骨腱界面的原位再生[6]。

利用去細胞技術制備的生物衍生支架材料具有組織天然相容、結構自然仿生的優勢。這類材料由于去除了組織內的細胞和抗原物質，因此避免了免疫排斥風險。同時，這類材料往往保留了與正常組織相似的組織成分和形態結構，能夠最大限度地保留原組織的力學性能[8]。在組織工程去細胞支架的研究中，學者們遇到諸多問題，他們往往在減少試劑殘留、基質成分保留和提高脫細胞效率等問題之間難以取舍。學者們采用物理方法對組織塊進行切割、打孔，試圖在利于細胞遷入、保留力學性能和提高去細胞效率之間找到平衡點[8-9]。一方面，類似“書頁”狀組織薄片切割通過增加去細胞液與組織的接觸面積，能夠顯著縮短組織去細胞的處理時間，避免細胞外基質成份的大量流失，并且能夠最大限度地保留原組織的力學性能。另一方面，薄片支架之間的固有物理間隙給干細胞的遷入提供了空間，這無疑有利于支架的再生命化和組織原位修復再生[10-11]。

針對單純去細胞支架中細胞成分丟失、難以再生命化的難點，采用去細胞支架材料負載具有修復效應的干細胞往往能夠重新賦予組織工程支架生物活性[12]。學者們通過制備一種形態結構仿生、成軟骨誘導性能優良的去細胞纖維軟骨書頁支架，并與宿主的自體脂肪間充質干細胞片合體組裝，最終制備成具有自主生命力的組織工程纖維軟骨移植物，該移植物能夠顯著促進纖維軟骨再生[13]。為了提高去細胞生物支架的仿生性能，學者們將獲取的骨、纖維軟骨和肌腱組織分別制成易于吸收的薄片書頁狀支架后，進行去細胞處理，并根據天然骨腱界面梯度漸變的結構和成分特征，將去細胞骨、軟骨、肌腱這3種支架進行堆疊組裝，從而構建結構與成分仿生的去細胞三相書頁支架[14]。相比于單一組織來源的支架骨腱界面移植物，三相支架能夠更好地模擬骨腱界面的梯度漸變特性。

在人工材料領域，學者們利用高分子材料作為首選的支架材料。目前多采用磷酸三鈣、羥基磷灰石和生物活性玻璃等材料。這些材料在體內降解緩慢、重復性好，具有易于調節、易于修飾的特點。能夠精確地控制材料的硬度、制備工藝及表面拓撲結構等特性，這使設計的支架能夠較好地模擬出正常骨腱界面的形態特征[7]。隨著一些具有良好的生物相容性和親和性的材料的出現，新近設計的組織工程支架更易于局部細胞的附著，并且能夠創造一個適合細胞增殖和分化的環境[7,15]。已有學者利用生物相容性較好的多聚物，制備了力學仿生的組織工程支架和補片以促進肌腱以及纖維軟骨層的再生，從而治療骨腱損傷性疾病[7]。針對單一材料的組織工程移植物難以在一個支架上實現差異化設計及仿生骨腱界面梯度結構設計的難題，分層仿生設計的高分子材料支架應運而生[15]。這種組織工程支架旨在模擬正常骨腱界面的漸變結構，從而重建骨腱界面的生物學功能。通過在體外制備了異質性的多層結構支架，來模擬天然骨腱界面結構和力學性能，且在不同區域誘導干細胞成骨、成肌腱分子特異性表達，旨在促進骨腱界面中骨、軟骨和肌腱的有序愈合。

2.種子細胞優化:具有修復能力的細胞在界面組織中的再生、組成和穩態中起著“原動力”的作用。一般來說，種子細胞可以分為兩種不同類型的細胞：功能細胞，如成纖維細胞，軟骨細胞和成骨細胞；未分化細胞，如間充質干細胞(MSCs)和組織特異性干細胞[7]。

功能細胞是不具備增殖能力的成熟體細胞，常選擇目標組織中的主要細胞成分來用作種子細胞。應用功能細胞能夠直接補充損傷區域丟失的組織細胞或者替代損傷后功能失調的殘留細胞。相較于難以確定最終分化方向的干細胞，功能細胞的生命路線通常更加確切可控。目前，已有大量研究采用軟骨細胞、肌腱細胞等應用于諸如軟骨缺損、肌腱損傷等運動系統損傷的治療[16]。

間充質干細胞是組織工程未分化細胞的理想選擇。它們來源于發育早期的中胚層，在成年個體的骨髓、脂肪等組織中保持靜息狀態，其增殖能力強、免疫原性低、多向分化潛能好，可在體內分化成包括骨、軟骨、肌肉、韌帶等多種類型的組織[6,17]。學者最早將骨髓間充質干細胞種植在腘繩肌腱移植物的表面，結果顯示復合干細胞的移植物能夠更快地與骨隧道愈合，在術后2周就形成非常明顯的纖維軟骨層[18]。其他諸如脂肪間充質干細胞、尿源性干細胞也被發現具有自我更新與多方向分化潛能，同時具備數量多、易于獲取的特點，已有研究證實它們在骨腱界面損傷修復中起到積極的作用[16]。

也有學者嘗試在肌腱組織中尋找具有增殖分化能力的內源性干細胞，并用來治療肌腱損傷?，F有的觀點認為骨、肌腱組織特異分布的干細胞能夠更好地適應組織原位的微環境，在植入后能夠保持較高的活性[17]。學者們收集前交叉韌帶來源的CD34陽性細胞，制備成富含種子細胞及相應細胞外基質的干細胞片，將干細胞片包裹在肌腱移植物的表面并植入前交叉韌帶重建的骨隧道內來促進骨腱界面的愈合[18]。

為了規避術后炎癥反應對外源性干細胞的損耗，學者們選擇在宿主的炎癥反應消退后，將干細胞注射到骨腱所在的關節內，通過緩釋具有趨化作用的生長因子來募集外源性干細胞到達骨腱界面的損傷局部，并參與其修復過程。此方案簡化了支架在體外負載細胞的步驟，一定程度上保障了植入細胞的存活率，并且有效地規避了術后早期炎性反應對外源性干細胞的損耗，這為開發骨腱界面組織工程治療方案提供了一種新模式，有利于進一步在臨床推廣應用[19]。

3.細胞因子控釋:探索不同生長因子組合和輸送模式對骨腱愈合的影響是界面組織工程在未來幾年將面臨的挑戰之一。研究表明，生長因子在骨腱界面的組織發育、穩態保持和損傷修復過程中發揮著重要作用，根據生理效應的不同主要分為分化誘導因子、血管生成因子、趨化因子等。不同的細胞因子對骨、軟骨、肌腱等多相組織的修復發揮著迥然不同的作用。研究表明，2型骨形成蛋白(BMP-2)、轉化生長因子(TGF-β)等能夠分別通過誘導組織成骨、成軟骨分化，血管內皮生長因子(VEGF)能夠誘導血管形成，基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)能夠募集干細胞至損傷區域[7,20]。骨腱界面結構的梯度漸變特征給細胞因子在局部的應用提出了更高的要求，要恢復損傷后骨腱界面的功能，就需要再生組織中的骨、軟骨、肌腱細胞，并合成、重塑相應的細胞外基質[6,20]。鑒于此，在骨腱界面中采用細胞因子策略需要重點關注成骨分化、成軟骨和成肌腱分化誘導因子的應用。

另外，嚴格控制生長因子的作用位置和濃度對于刺激特定細胞分化的行為至關重要。某些生物因子與支架負載不強，在植入體內后會以瀑布式釋放的模式大量分布在移植物周圍，局部高濃度的生物因子有引起細胞凋亡、異常分化的風險[7]。而當大量早期釋放的生物因子被滅活后，后續從支架中釋放的殘留細胞因子不足以發揮足夠的生物效應。為了規避上述生物因子應用的不足，學者們通過修飾支架材料、修飾生物因子、制備緩釋微球等方式來實現生物因子在材料上的附著和緩慢釋放[20]。

為了提高細胞因子在支架材料上的緩釋效果，學者們另辟蹊徑，他們合成并純化了具有膠原結合特性的基質衍生蛋白1α(C-SDF-1α)，并證實具有膠原結合特性的SDF-1α有著與正常SDF-1α(N-SDF-1α)相當的干細胞募集效能，C-SDF-1α可特異性地結合在去細胞纖維軟骨書頁支架上的膠原成分，從而實現生物因子在支架上的緩慢釋放。

四、展望

隨著材料科學和醫學的不斷發展，組織工程的理論和技術在骨腱界面中的應用已達到前所未有的高度。學者們在探尋新材料、新工藝的同時，更加關注材料和移植微環境之間的相互作用，旨在讓設計的移植物更加的“智能化”、“功能化”，更加關注并把握移植的材料和細胞在宿主體內經歷的生命過程。學者們從結構、成分、力學特性的角度出發，使組織工程支架更加貼近天然組織，以提供更加合適的細胞微環境。同時，組織特異性干祖細胞的發現給骨腱界面的研究帶來更多可能性，在骨腱界面中存在著特異性干細胞，利用這些內源性干細胞能夠更加高效地促進骨腱界面的損傷修復，這也是未來研究的方向之一。有一點我們可以確定的是，制備更高程度仿生的組織工程移植物是實現骨腱界面有序再生的重要手段。同時多學科的交叉整合同樣也是組織工程發展的必要途徑，相信通過實現對天然骨腱界面結構和成分的高度模擬，實現骨腱界面損傷后的原位有序再生將不再是鏡中之花，水中之月。