小白菊內酯對巨噬細胞抗氧化能力的影響研究

林珊，戴麗冰，翁春輝，趙向陽，郭愛芳

（1.廣東燕嶺醫院口腔科，廣東 廣州 510507；2.廣州市紅十字會醫院，暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院，廣州市創傷外科研究所，廣東 廣州 510220；3.廣州市紅十字會醫院，暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院口腔科，廣東 廣州 510220）

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，保護巨噬細胞的完整性是保障其功能穩步發揮的前提。巨噬細胞的結構及功能完整性受外源自由基的侵襲時，會出現被氧化分解或裂解，嚴重降低其對機體的免疫保護屏障功能[1-2]。因此，提高機體免疫力，首先應提升巨噬細胞抗氧化能力。目前，已有關于提高免疫細胞抗氧化能力的研究，相應的抗氧化物質主要為維生素類，如維生素C、維生素E以及礦物質類，如酵母硒[3]。隨著我國對中草藥現代醫學的深入研究，有關中草藥提取物抗氧化物質功效的試驗研究也備受關注。本研究以菊科植物純化提取的半萜烯內脂類化合物小白菊內酯為研究對象，對其影響巨噬細胞抗氧化能力進行相關研究，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 巨噬細胞 外購15只SPF級8周Balb/c小鼠（維通利華），以10 μg/g 體質量腹腔注射大腸桿菌脂多糖500 μL/只構建炎癥模型動物。與模型構建后24～72 h 內監測小鼠血液CRP 指標變化，對成功獲取的15 只炎癥模型動物處死后置于無菌操作臺，利用冷PBS（pH 7.4～7.6）進行腹腔沖擊收集巨噬細胞進行體外離心和分離培養（37 ℃5%CO2），經細胞形態學、堿性磷酸酶檢測及吞噬試驗鑒定后，篩選出巨噬細胞分為兩份，一份凍存，另一份以1×104個/mL加入96孔細胞培養板中繼續培養。

1.1.2 儀器及試劑 CO2細胞培養箱（美國Sheldon 公司），低溫離心機（美國Herculeus公司），多功能酶標儀（美國Bio-Rad 公司），小白菊內酯（PTN，美國Sigma 公司），脂多糖（LPS，Sigma L2630），鼠IL-1βELISA 試劑盒（聯科生物，70-EK201B/3-24），鼠 TNF-α ELISA 試劑盒（聯科生物，70-EK282/3-24），鼠IL-6ELISA 試劑盒（聯科生物，70-EK206/2-24），維生素 C（上海阿拉丁），丙二醛（MDA，Sigma MAK085），超氧化物歧化酶（SOD，Sigma 19160），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，Sigma CGP1）。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞的體外培養及分組 巨噬細胞體外分離及培養：炎癥模型動物建模完成后，在注射脂多糖后24、48、72 h進行血樣采集監測動物體溫及血清CRP指標變化篩選出炎癥構建成功的模型動物。確認動物炎癥模型成功后，當日對其處死，并采用冷PBS 腹腔沖擊收集巨噬細胞1 000 rpm 離心8 min，獲得的疑似巨噬細胞以1×104個/mL濃度培養到96孔細胞培養板中，200 μL/孔。細胞培養6～8 h 后進行相差倒置顯微鏡檢查細胞形態，標注出有偽足的單核細胞，培養第72 小時對標注孔細胞行墨汁吞噬功能檢測（10%墨汁50 μL/孔），于倒置顯微鏡下計數200個細胞，計算其吞噬率。同時，對培養第72小時標注孔實施堿性磷酸酶染色，同樣于倒置顯微鏡下計數200個細胞，計算胞漿棕黃色或棕黑色細胞陽性率。

分組：經體外分離驗證陽性的巨噬細胞孔補加含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養基，于體外培養5～7 d，當96孔細胞培養板孔底鋪滿80%左右細胞時，使用0.25%胰酶消化離心，去上清后沉淀細胞平均分為兩部分，一部分凍存（凍存液：9 份血清+1 份DMSO），另一部分巨噬細胞繼續以1×104個/mL稀釋鋪板培養，共計15塊96孔板，200 μL/孔。將含有巨噬細胞的15塊96孔細胞培養板隨機分為5組，每組3塊，分別為對照組、A組、B組、C組及D組。各組巨噬細胞培養板在培養第48小時分別對應0 μmol/L PTN+1 mg/L LPS（空白對照）、7.5 μmol/L PTN+1 mg/L LPS、15 μmol/L PTN+1 mg/L LPS、30 μmol/L PTN+1 mg/L LPS及200 μmol/L維生素C+1 mg/L LPS，上述各組細胞在相同培養條件下實施體外持續共培養試驗。

1.2.2 細胞炎性因子水平及抗氧化能力檢測 以加入PTN為0 h，0 h各組間的IL-1β、TNF-α和IL-6水平比較差異無統計學意義。依據分組加入PTN 后，于培養第24、48 及72 小時收集各組細胞上清液，對細胞上清液中炎性因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平進行間接酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，同時，對細胞抗氧化能力指標（SOD、MDA及GSH-Px）水平進行檢測。以上各種指標均嚴格依照廠家提供的產品說明書進行檢測，同時，對陽性對照分梯度制作標準曲線，依據標準曲線計算各指標含量。

1.3 觀察指標 比較各組炎性因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）水平及細胞抗氧化能力指標（SOD、MDA及GSH-Px）水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以“”表示，行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠巨噬細胞形態觀察、堿性磷酸酶染色陽性率及吞噬率 培養6～8 h觀察細胞呈現圓形或橢圓形，部分伸出偽足呈現三角形或不規則多邊形，培養24 h觀察細胞均出現偽足且形態不變。15只小鼠培養72 h經墨汁吞噬率及堿性磷酸酶染色陽性率比較發現，平均每200 個細胞中有191 個出現墨汁吞噬染色，吞噬率為95.5%；堿性磷酸酶染色統計，平均每200個細胞中有183個被染色沉淀，陽性率為91.5%。

2.2 各組不同時間段細胞炎性因子水平變化比較 隨著培養時間延長，A 組、B 組、C 組及 D 組 IL-1β、TNF-α 及 IL-6 水平均呈下降趨勢，而對照組IL-1β、TNF-α及IL-6水平炎性因子水平均呈上升趨勢。與PNT共培養24、48 h，C組IL-1β顯著低于其他各組（P＜0.05），72 h 時，對照組IL-1β 水平顯著高于其他各組（P＜0.05）；與PNT共培養24 h，C組TNF-α顯著高于其他各組（P＜0.05），72 h 時，C 組TNF-α 顯著低于其他各組（P＜0.05），且對照組顯著高于其他各組（P＜0.05）；與PNT共培養24、48及72 h，各組IL-6水平比較差異無統計學意義，見表1。

表1 不同時間段各組細胞炎性因子水平變化比較（）Table 1 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in different time among different groups()

表1 不同時間段各組細胞炎性因子水平變化比較（）Table 1 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in different time among different groups()

注：IL-1β，白介素1β；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-6，白介素-6。與對照組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05

組別對照組A組（n=3）B組（n=3）C組（n=3）D組（n=3）72 h 105.65±9.91 79.33±7.23 83.44±11.23 84.30±16.43 80.88±20.26 IL-1β（mg/L）24 h 59.78±6.27b 58.85±6.46b 57.88±6.82b 43.64±8.18 58.66±9.23b 48 h 60.82±8.83b 53.34±9.96b 52.78±7.34b 41.45±4.67 52.43±8.74b 72 h 62.13±5.44 47.49±6.16a 44.29±5.24a 40.33±2.14a 46.63±3.17a TNF-α（ng/L）24 h 202.15±10.44b 228.34±19.66b 224.23±34.36b 314.87±38.26 236.17±37.88b 48 h 235.23±21.56 216.23±28.18 208.18±63.12 221.23±45.96 218.94±45.23 72 h 258.88±29.19b 203.10±29.57ab 197.58±20.16ab 155.80±26.21a 196.93±20.41ab IL-6（pg/mL）24 h 72.15±10.44 112.23±9.87 119.16±13.54 129.23±21.34 107.99±20.24 48 h 84.34±11.33 86.88±10.44 80.95±17.24 91.26±14.67 89.13±13.36

2.3 各組不同時間段細胞抗氧化能力指標SOD、MDA 及GSH-Px水平變化 與PNT共培養24 h，各組SOD差異無統計學意義，共培養 48 及 72 h，A 組、B 組、C 組及 D 組 SOD 均顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著培養時間延長，A 組、B組、C組及D組SOD水平呈下降趨勢；隨著培養時間延長，各組MDA 均呈下降趨勢，共培養24 h，各組MDA 比較差異無統計學意義，共培養48及72 h，C組MDA均顯著低于其他各組（P＜0.05）；隨著培養時間延長，A 組GSH-Px 水平呈現下降趨勢，共培養24 h，各組GSH-Px水平比較差異無統計學意義，共培養48及72 h，C組GSH-Px水平均顯著高于其他各組（P＜0.05），見表2。

表2 不同時間段各組細胞抗氧化指標SOD、MDA及GSH-Px水平比較（）Table 2 Comparison of SOD,MDA and GSH PX levels in different time among different groups()

表2 不同時間段各組細胞抗氧化指標SOD、MDA及GSH-Px水平比較（）Table 2 Comparison of SOD,MDA and GSH PX levels in different time among different groups()

注：SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；GSH-Px，谷胱甘肽過氧化物酶。與對照組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05

組別對照組A組（n=3）B組（n=3）C組（n=3）D組（n=3）72 h 67.46±8.81b 73.34±6.78b 73.46±7.01b 90.46±10.64 73.14±9.16b 24 h 49.10±8.37 52.15±9.57 53.19±10.79 55.26±14.19 53.56±9.74 48 h 44.14±8.16 58.33±10.23a 58.74±8.96a 68.86±11.46a 60.66±8.98a 72 h 38.26±10.13 60.19±11.44a 61.35±9.87a 75.79±9.99a 65.75±11.09a 24 h 1.01±0.22 1.07±0.27 1.10±0.31 1.08±0.29 1.07±0.40 48 h 0.84±0.23b 0.69±0.16b 0.69±0.24b 0.34±0.14 0.77±0.09b 72 h 0.77±0.18b 0.55±0.14b 0.54±0.16b 0.28±0.13 0.54±0.14b 24 h 72.89±11.47 69.34±8.48 71.61±7.24 75.02±8.59 68.60±10.32 48 h 70.98±8.89b 70.12±9.24b 72.89±6.45b 89.89±10.91 70.33±8.08b

3 討論

小白菊內酯是一種具有抑菌抗腫瘤作用的生物活性物質，是野生甘菊的提取物，目前已廣泛應用于臨床，其中在痛風、類風濕性關節炎以及抗腫瘤方面具有顯著效果[4-5]。有關小白菊內酯上述功效的作用機理，有研究發現小白菊可通過NF-kappa B通道抑制從而起到促進淋巴細胞、巨噬細胞增殖抑菌功效。但小白菊內酯對免疫細胞的影響功效機制以及對炎性因子的作用研究較少，小白菊內酯對免疫細胞增殖過程中細胞功效及抗氧化功能的報道缺乏大量數據參考[6-7]。巨噬細胞是參與機體免疫的重要抗原遞呈細胞，通過MHC分子與抗原結合從而誘發機體T 細胞及B 細胞參與特異性免疫反應，然而巨噬細胞在參與免疫過程中通過釋放促炎因子而起到機體保護作用，并通過釋放抗炎細胞因子從而有效調節機體的炎癥反應抵御外源致病因素侵襲[8-9]。有研究報道，小白菊內酯在牙周炎的治療中，主要通過激活巨噬細胞活性，促進炎性因子介入從而有效抑制外界病原的侵襲；同時，小白菊內酯可通過調節抗氧化酶系統改善巨噬細胞的抗氧化能力[10-12]。

目前機體的抗氧化系統主要由小分子物質和抗氧化酶兩部分組成，小分子物質中主要以維生素C和維生素E的應用較多，而抗氧化酶中以超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶為主[13-14]。通過調節機體內抗氧化物酶的活性可有效抑制體內自由基產生，從而抑制細胞氧化維持細胞正常功能，目前對細胞抗氧化能力的評價中除了以SOD、MDA及GSHPx水平變化進行分析外，SOD及GSH-Px參與抗氧化重要的酶，通過其含量可抑制自由基的作用，而MDA是機體體脂氧化代謝的重要物質，MDA 在機體的水平與機體抗氧化能力呈負相關[15-16]。隨著現代醫學評定標準的不斷完善，目前的疾病療效判定中，主要以TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子水平來評定疾病改善情況，這些炎性因子均是由單核巨噬細胞產生的，主要參與機體的多種免疫及生理反應，在機體維持免疫平衡中發揮重要作用[17]。

本研究結果表明，陽性巨噬細胞占比90%以上，細胞形態符合巨噬細胞生長狀態；隨著培養時間延長，A組、B組、C組及D組IL-1β、TNF-α及IL-6水平均呈現下降趨勢，而對照組的IL-1β、TNF-α及IL-6水平均呈上升趨勢，表明PTN可抑制炎性因子 IL-1β、TNF-α 及 IL-6 的分泌；在與 PNT 共培養24 h，C 組IL-1β、TNF-α 均顯著高于其他各組（P＜0.05），且共培養48 h，C組的IL-1β顯著低于其他各組（P＜0.05），說明30 μmol/L PTN 在于LPS 共培養初期可提高巨噬細胞功能，并促進炎性因子分泌，隨著培養時間延長，LPS 致炎量被中和后，巨噬細胞的炎性分泌量相應降低且受多余的PTN 影響進一步抑制巨噬細胞致炎因子的分泌。共培養48 及72 h，C組GSH-Px 水平均顯著高于其他各組（P＜0.05），C 組MDA水平顯著低于其他各組（P＜0.05），72 h時，對照組SOD水平均顯著低于其他各組（P＜0.05），說明隨著培養時間延長C組PNT 可提高巨噬細胞的抗氧化能力，降低細胞裂解減少丙二醛的分泌。同時，各組在不同時間段的IL-6水平比較差異無統計學意義，初步認定PTN 對炎性因子IL-6 無顯著效果，但仍需進一步給予證實。

綜上所述，小白菊內酯可抑制脂多糖對巨噬細胞的致炎作用，同時以30 μmol/L PTN量加入到巨噬細胞培養基中，早期可抑制炎性因子分泌；同時，小白菊內酯可提高巨噬細胞的抗氧化能力，且30 μmol/L PTN+1 mg/L LPS 進行體外抗氧化效果最佳。