某醫院耐碳青霉烯酶類鮑曼不動桿菌耐藥基因研究和同源性分析

沈進，孫少君，楊茜云，馬軍，王曉明，王秋波

（無錫市第九人民醫院（無錫市骨科醫院）檢驗科，江蘇 無錫 214000）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii，AB）是一種常見的醫院感染的非發酵革蘭氏陰性桿菌，常引起傷口感染、尿路感染、皮膚軟組織感染、菌血癥等，特別是在重癥監護病房中，還會導致免疫力低下人群發生院內感染。由于醫院長期頻繁使用抗生素以及鮑曼不動桿菌具有天然和獲得性耐藥能力[1-2]，使多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDR-AB）的分離率呈逐年上升趨勢。近年來，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（CRAB）也逐漸增多，檢出率可達32.04%[3]，已成為21 世紀醫療衛生行業面臨的巨大挑戰[4-7]。為了解CRAB在本院的流行現狀和院內感染情況，本研究分析本院耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥基因及藥物敏感情況，并采用ERIC-PCR 方法進行同源性分析，旨在減少院內感染以及預防性臨床用藥提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 收集2019年1—11月本院患者入院采集的所有臨床標本，包括患者的創口分泌物、痰液、中段尿等，排除同一患者相同部位的同一菌株。

1.2 方法 送檢的患者標本參照《全國臨床檢驗操作規程》（第四版）進行分離培養和鑒定藥敏試驗。

1.3 細菌鑒定和藥敏試驗 菌種鑒定和藥敏試驗均采用BD Phoenixl00 NMIC/ID-4復合板上機自動檢測，采用KB法檢測相應藥敏補充試驗，藥敏結果的判讀依據美國臨床實驗室標準化協會（CLIS）最新版標準執行。質控菌株包括銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922，均由無錫市臨檢中心提供。抗菌藥物紙片購自英國Oxoid公司。

1.4 試劑及主要儀器 10×buffer、Taq酶、dNTP購自大連寶生物公司，PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 擴增儀使用MJ-PTC-100（BIO-RAD），凝膠成像儀器購自上海天能公司。

1.5 目的基因檢測 用煮沸法提取細菌DNA，用多聚酶鏈反應（PCR）方法檢測碳青霉烯類耐藥基因，PCR 引物[8]詳見表1。PCR 反應體系為50 μL，包括DNA 模板5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Taq 酶0.25 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水33.75 μL，PCR擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，并采用凝膠成像儀器判讀結果。

表1 目的基因引物序列和產物長度Table 1 Target gene primers sequences and length of products

1.6 同源性分析 采用ERIC-PCR 對OXA51 陽性菌株同源性分析，引物為5’-AAGTAAGTGACT-GGGGTGAGCG-3’反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 8 min，共35個循環，72 ℃16 min[9]，擴增出的條帶相同為同一基因型，主條帶相同，負條帶相差1～2條為基因相似或密切相關，不符合上述條件者為不同基因型。

1.7 統計學方法 用WHONET 5.6對多重耐藥菌進行統計學篩選，并進行菌株耐藥性分析。

2 結果

2.1 標本分布 56 株CRAB 中來自于創口分泌物34 株，痰液 18 株，中段尿液 3 株，導管 1 株，其中 ICU 13 株，內科 12株，其他31株分布于各個骨科，手外科病區，見表2。

表2 56株CRAB細菌標本類型分布Table 2 Distribution of 56 strains of CRAB

2.2 藥敏結果 56株細菌的耐藥結果均為多重耐藥，22種藥物中18種藥耐藥性＞95.0%，且對亞胺培南、美羅培南的耐藥率均＞98.0%。耐藥率最低者為替加環素（9.6%），見表3。

表3 56株CRAB的藥敏結果Table 3 Suscepitbility rate of 56 strains of CRAB to antimicrobial agents

2.3 目的基因的PCR檢測結果 56株耐碳青霉烯酶類鮑曼不動桿菌OXA51 基因PCR 檢測結果，48 株細菌陽性，陽性率為85.7%；OXA23 基因檢測結果，52 株細菌陽性，陽性率為92.9%。

2.4 ERIC-PCR結果 OXA23和OXA51陽性菌株同源性分析，38株屬于同一型，部分結果，見圖1。

圖1 OXA51菌株ERIC-PCR電泳圖譜Figure 1 ERIC-PCR electrophoresis of OXA51 positive strains

3 討論

鮑曼不動桿菌是醫院內常見的獲得性病原菌，可引起不同類型的感染，從輕微的軟組織感染到更嚴重的感染，如呼吸機相關性感染和敗血癥等。據統計，2012 年至2016 年非發酵革蘭陰性桿菌中，鮑曼不動桿菌的檢出率一直居于第1位[10-11]。

鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的機制主要包括碳青霉烯酶的產生[12]，細胞膜孔蛋白表達缺失或減少，青霉素結合蛋白的改變以及藥物外排泵的活性增強[13]，最主要的機制是產生碳青霉烯酶[14]。本研究選擇四種碳青霉烯類酶中分布最廣，最重要的D 類-絲氨酸蛋白酶（OXAs）bla-OXA23、blaOXA51、blaOXA24、blaOXA58 四種作為研究對象。56 株 CRAB 中 ，OXA51 基 因 48 株 陽 性 ，陽 性 率 為85.7%，OXA23基因52株陽性，陽性率為92.9%，其他目的基因均為陰性。這可能由于OXA58型碳青霉烯酶在歐洲分布的較多，在我國分布較少，與李春等[15]研究結果相符。

含有ERIC序列等重復基因序列的細菌基因組可作為分子生物學工具來評估許多細菌分離株的細菌變異性。ERIC-PCR分析技術是區分鮑曼不動桿菌和其他導致醫院感染的革蘭氏陰性桿菌最快的分型技術之一。本研究結果表明，流行病學聯系在鮑曼不動桿菌的分類上有一定的影響，對OXA51陽性菌株做ERIC-PCR分型，38株屬于同一型，分別分布于ICU、內科、骨科，表明本院多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥機制可能為產生OXA51型碳青霉烯類酶。

由于鮑曼不動桿菌具有獲得性和上調耐藥的能力以及大量使用廣譜抗菌藥物，導致臨床選擇治療鮑曼不動桿菌感染的藥物非常有限[16-17]。碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強等特點，常被臨床用于治療鮑曼不動桿菌的感染，由于臨床的廣泛使用，導致其耐藥率呈逐年升高的趨勢[18]。有研究顯示，耐碳青霉烯類藥鮑曼不動桿菌（CRAB）對臨床常用抗菌藥物耐藥，且多數僅對替加環素和多粘菌素敏感的耐藥菌株。有研究顯示，不動桿菌屬（鮑曼不動桿菌占比93.4%）對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.0%和70.5%，2017年CHINET細菌耐藥監測顯示，鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率接近66.7%[19-20]。由于CRAB 對常用藥物不敏感，一旦感染上CRAB，則面臨無有效藥物治療的情況[21-22]。

本研究藥敏結果顯示，本院分離出的CRAB全部為多重耐藥，且耐藥性較嚴重。亞胺培南和美羅培南的耐藥率均＞98.0%，22 種藥物中有18 種藥物耐藥率＞98.0%。耐藥率最低的藥物為替加環素，該藥是使用K-B 方法檢測的，可作為本院經驗用藥。本院56株多重耐藥鮑曼不動桿菌對常用藥物耐藥情況嚴重，主要菌株類型為OXA23 和OXA51 型，臨床需做好多重耐藥桿菌的防護感控以及隔離措施，實驗室需做好耐藥性監測，防止多重耐藥桿菌在醫院暴發流行。