不同樣本中巨細胞病毒DNA載量在艾滋病合并巨細胞病毒肺炎早期診斷中的作用

鄧佳，李寧沙，陳勇

（長沙市第一醫院檢驗科，湖南 長沙 410005）

獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）是人類免疫缺陷病毒（HIV）感染機體后引起的一種免疫缺陷性疾病。在AIDS病程中，機體的免疫功能被破壞，諸多病原微生物入侵導致機會性感染[1]。巨細胞病毒是艾滋病患者重要的機會性感染病原體之一，當機體免疫功能下降時，病毒被激活導致顯性感染[2-3]。肺是艾滋病最易累及的器官之一，有研究報道，在AIDS患者尸檢報告中，16.7%～73.7%合并肺部巨細胞病毒感染，在有效的抗病毒治療后，CMV終末器官疾病的發生率大大降低[4-5]。本研究旨在探討不同樣本中CMV DNA 載量在艾滋病合并CMV肺炎早期診斷中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2010年1月至2017年6月在長沙市公共衛生救治中心艾滋病科住院首次診治的AIDS合并CMV肺炎患者（AIDS合并CMV肺炎組，n=41）與單純AIDS患者（單純AIDS 組，n=53）的臨床資料。AIDS 合并 CMV 肺炎組，男 29 例，女 12 例；年齡 21～59 歲，平均年齡（39±10）歲。單純 AIDS 組，男 44 例，女 9 例；年齡 22～60 歲，平均年齡（41±10）歲。兩組臨床資料比較差異無統計學意義，具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 診斷標準 AIDS診斷標準：所有患者血液HIV抗體檢測初篩及確證實驗均為陽性，臨床表現及體征符合“艾滋病診療指南（2015）”。活動性CMV肺炎診斷標準：出現肺部感染臨床表現，影像學提示間質性肺炎，血液及肺泡灌洗液中檢測CMV DNA 陽性，血清中CMV IgM 陽性。肺組織細胞學檢查中含CMV的包涵體，并排除其他病原體感染。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 試劑與儀器：使用ABI7500熒光定量PCR儀檢測PBMC和BALF中CMV DNA載量，人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司；人外周血單個核細胞分離液（Ficoll）購自天津灝洋生物科技有限公司。

1.3.2 標本采集與處理 所有入組患者外周靜脈采集EDTA-K2 抗凝血2 mL，使用人外周血單個核細胞分離液（Ficoll）分離PBMC，分離步驟嚴格按照試劑說明書進行。支氣管肺泡灌洗液的獲取由艾滋病科專業臨床醫師完成。

1.3.3 熒光定量PCR 根據待測樣本、陰陽對照以及定量參考品的數量，按比例取相應量的反應液、酶混合液及內標，充分混勻后配成PCR-混合液。在每個PCR反應管中分別加入上述處理后的待測樣本、陰陽對照以及定量參考品各10μL，再在每管加入PCR-混合液40 μL，混勻后瞬時離心，放入PCR 擴增儀。熒光檢測通道選擇及循環參數設定均嚴格參照說明書，設置完畢后運行反應程序。

1.4 觀察指標 比較兩組CMV DNA 陽性率和載量，同時采用 ROC 曲線分析 PBMC 和 BALF 中 CMV DNA 載量對AIDS合并CMV肺炎的早期診斷價值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析。檢測結果呈非正態分布數據，以中位數（四分位數）進行表示，兩組間采用兩獨立樣本非參數檢驗（Mann-Whitney檢驗），ROC曲線分析用于評估各指標最佳截斷值、曲線下面積、敏感度及特異度等，并分析聯合檢測時性能指數。

2 結果

2.1 兩組PBMC 和BALF 中CMV DNA 陽性率和載量比較AIDS 合并CMV 肺炎組中CMV DNA 陽性率高于單純AIDS 組，且 BALF 中 CMV DNA 陽性率高于同組中 PBMC樣本（P＜0.05）。其中 AIDS 合并 CMV 肺炎組 PBMC 中CMV DNA 陽性率為 78.0%（32/41），而 BALF 中 CMV DNA陽性率為 100.0%（41/41）；單純 AIDS 組中 PBMC 中 CMV DNA陽性率為28.3%（15/53）,而BALF中CMV DNA陽性率為 50.9%（27/53）。AIDS 合并 CMV 肺炎組 PBMC 中 CMV DNA 載量為2.19×103（5.31×102，6.77×103）Copies/mL，高于單純AIDS組的0（0，4.23×102）Copies/mL，差異有統計學意義（Z=-5.047，P＜0.01）；同時，AIDS 合并CMV肺炎組BALF中CMV DNA載量為7.43×104（2.02×104，3.11×105）Copies/mL，高于單純AIDS 組的4.98×102（0，8.63×103）Copies/mL，差異有統計學意義（Z=-5.515，P＜0.01）。此外，兩種樣本類型中CMV DNA 載量進行相關分析，結果顯示二者呈正相關，Pearson相關系數r值為0.533，見表1。

表1 兩組CMV DNA陽性率和載量比較（）Table 1 Comparison of the CMV DNA positive rate and load between the two groups()

表1 兩組CMV DNA陽性率和載量比較（）Table 1 Comparison of the CMV DNA positive rate and load between the two groups()

注：CMV，巨細胞病毒；PBMC，外周血單核和細胞；BALF，支氣管肺泡灌洗液。與單純AIDS組比較，aP＜0.01

組別AIDS 合并CMV肺炎組單純AIDS組BALF 7.43×104（2.02×104，3.11×105）a 4.98×102（0，8.63×103）例數41 53 CMV DNA陽性率（%）PBMC 78.0 28.3 BALF 100.0 50.9 CMV DNA載量（Copies/mL）PBMC 2.19×103（5.31×102，6.77×103）a 0（0，4.23×102）

2.2 ROC 曲線分析兩種樣本的診斷價值 ROC 曲線分析顯示，PBMC 的曲線下面積（AUC）為0.899，最佳診斷界值為4.27×102Copies/mL，診斷靈敏度為80.8%，特異度為88.5%；樣本為 BALF 時，AUC 為 0.945，最佳診斷界值為1.62×104Copies/mL，診斷靈敏度為92.3%，特異度為81.2%。PBMC與BALF聯合檢測結果顯示，AUC為0.963，診斷靈敏度為96.2%，特異度為92.3%，見圖1。

圖1 ROC曲線Figure 1 ROC curve

3 討論

巨細胞病毒是人類病毒性肺炎的常見病原體之一，可通過胎盤、接觸、飛沫、性交或器官移植等途徑感染[6-7]。目前診斷CMV肺炎依據主要包括病理學發現CMV包涵體、病毒培養、CMV DNA檢測以及血清CMV抗體檢測等。Tan SK等[8]發起一項成人CMV 肺炎的臨床研究發現，在分別使用CMV PCR、CMV 快速培養和傳統培養檢測BALF CMV 時，CMV PCR 較病毒培養具有更高的敏感度和陰性預測值，由于PCR檢測具有較高的敏感度，故即使結果為陰性，仍有診斷價值，可基本排除病毒感染。Honda J 等[9]開展了一項對363例CMV肺炎患者的回顧性研究，所有患者共采集了317份痰標本、94 份 BALF 標本、291 份血標本及 180 份尿標本。所有樣本采用PCR 檢測CMV DNA，其陽性率BALF 為10.6%、尿液為7.8%、痰液為6.9%和血液為4.1%。應用肺組織病理學檢測CMV 包涵體的方法診斷CMV 肺炎34 例，陽性率為9.4%。表明BALF有較高的CMV DNA陽性率，故通過檢測BALF中CMV DNA的診斷CMV肺炎，具有快速，安全，特異性和陽性率高等優點。

在AIDS 的病程中，患者免疫力被逐步破壞，CMV 激活導致肺炎的發生，由于臨床表現缺乏特異性，無明顯前驅癥狀，增加了疾病診斷的難度，故早期診斷艾滋病并發CMV肺炎對改善患者預后具有重大意義[10]。謝周華等[11]對6例艾滋病合并巨細胞病毒肺炎患者進行臨床特點、各項檢驗與影像學指標以及治療與預后分析發現，6例患者臨床表現及影像學檢查無明顯特異性，血清學檢測發現，CMV-IgM 陽性僅3例，CMV-PP65抗原檢測陽性僅2例，最終結局為發展到后期6例患者均出現呼吸衰竭而死亡。賈春輝等[12]通過對48 例艾滋病合并巨細胞病毒感染患者的臨床表現以及免疫功能分析發現，CMV 感染多發生于晚期AIDS 患者，可導致AIDS 患者T 淋巴細胞亞群發生異常，如異常激活、比例倒置等，最終引起多器官、多系統病變，嚴重威脅AIDS 患者的生命安全，因此，需早期篩查CMV 感染指標以協助臨床早期診療。

綜上所述，對于 AIDS 合并 CMV 肺炎患者，PBMC 和BALF 中CMV DNA 載量的檢測相當關鍵，結果無論陽性與否均具有診斷價值。聯合檢測PBMC 和BALF 中CMV DNA載量的診斷價值優于單項檢測，可顯著提高AIDS合并CMV肺炎患者的早期確診率，為臨床及時使用抗病毒藥物，改善AIDS合并CMV肺炎患者的預后提供實驗室依據。