1例早發腦型肝豆狀核變性家系ATP7B基因突變和臨床表型分析

錢南南， 王久香， 裴 培， 楊 悅， 楊文明

肝豆狀核變性(Wilson’s Disease，WD，MIM 277900)是一種常染色體隱性遺傳的以銅代謝紊亂為特征的代謝性疾病，主要表現為肝功能異常、神經或精神損害、角膜可見K-F環(Kayser-Fleischer ring)甚至腎損傷。臨床上，該病主要分為肝型(肝功能損傷)、腦型(神經精神異常)和混合型(二者都異常)?；颊咭话阍?～35歲發病，兒童以肝型為主，腦型患者少見[1，2]。目前發現WD是由ATP7B基因突變所導致，我們對1例中國漢族早發型腦型WD家系進行ATP7B變異鑒定，以明確其遺傳學病因，為該家系的疾病診斷提供遺傳學證據，對家系其他成員的再發風險進行指導。

1 對象與方法

1.1 對象 先證者，女，13歲。2017年7月份漸出現口角流涎、言語不清，寫字慢、字體歪斜。就診于當地衛生所考慮“胃炎”，予口服藥治療未見好轉(具體用藥不詳)。發病16 m開始出現左手不自主抖動，記憶力明顯減退。患者雙眼角膜K-F環陽性，腦部MRI顯示雙側基底節區、黒質對稱性異常低信號(見圖1)，24 h尿銅 621.7 μg/d，ALT、AST、GGT和AKP正常，CER 0.093 g/L(參考值0.2～0.6 g/L)，考慮“肝豆狀核變性”，予排銅、保腦等綜合治療后口角流涎及左手不自主抖動較前好轉?；颊?歲時患過病毒性腦炎。

表1 ATP7B外顯子及其側翼區PCR擴增引物序列

先證者腦部MRI顯示雙側基底節區、黒質對稱性異常低信號圖1 先證者頭部MRI

本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經中國合肥安徽中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準，本研究參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 EDTA抗凝管采集先證者及家系其他成員的外周血3 ml(見圖2A)，全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，并用分光光度計(Eppendorf，德國)檢測其濃度和質量。

1.2.2 基因測序 利用Primer Premier 5 軟件設計擴增包含ATP7B基因外顯子及其外顯子內含子連接區引物，由武漢擎科生物有限公司合成(見表1)。PCR體系(50 μl)：5X PrimeSTAR緩沖液(含Mg2+)10 μl (Takara)、基因組DNA 100 ng、上下游引物各0.2 μmol/L、dNTP Mixture 0.2 mmol/L(Takara)，PrimeSTAR DNA polymerase 0.5U(Takara)，用H2O補足至50 μl體系。PCR反應條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃ 變性10 s；55 ℃～60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物送武漢擎科生物有限公司用ABI PRISM 3100測序儀測序。測序結果與NCBI數據庫中的ATP7B基因序列進行比對(見圖2B-2E)。

2 結 果

ATP7B基因測序結果：外顯子直接測序結果顯示，先證者ATP7B基因存在c.2333G>T和c.2975C>T復合雜合錯義變異(見圖2C)，分別導致ATP7B第778位精氨酸變成亮氨酸，第992位脯氨酸變成亮氨酸。經檢索HGMD數據庫、dbSNP、千人基因組等數據庫證實，c.2333G>T和c.2975C>T均為已知WD致病位點。先先證者母親攜帶c.2333G>T(p.Arg778Leu)突變(見圖2B)，先證者父親攜帶c.2975C>T(p.Pro992Leu)突變(見圖2C)。先證者的弟弟攜帶c.2333G>T(p.Arg778Leu)突變(見圖2E)。

A：先證者家系圖，箭頭指示先證者；B～E：ATP7B測序結果(正向)，箭頭指示變異位點圖2 先證者家系及測序結果圖

3 討 論

WD是由于體內銅離子異常累積導致的一種罕見隱形遺傳病。ATP7B是目前已知的WD致病基因，其定位于13q14.3，編碼含有1465氨基酸殘基的跨膜蛋白。銅離子的代謝障礙導致其在腦部、肝臟、眼底甚至腎臟累積，導致患者出現肝硬化、神經精神紊亂、角膜K-F環甚至腎損傷。因此早診斷、早治療可減少患者肝、腦等組織的損傷，延緩病情進展，明顯提高WD患者的生存質量，最終回歸家庭和社會?；颊咦猿錾创嬖阢~代謝障礙，一般3歲以后才開始出現癥狀，臨床表現各異且大部分為非特異性，因此早期診斷仍較為困難[3]。本文先證者發病初期口角流涎、言語不清，曾考慮胃炎，外院治療后未見好轉。發病4 m后，流涎、言語不清加重，開始出現左手不自主抖動。

目前ATP7B基因已經發現有600多個WD致病突變位點。H1069Q是目前中歐最常見的WD突變位點，在波蘭、羅馬尼亞，奧地利等中歐國家的等位基因頻率為30%～60%[4]。R778L是日本、韓國、中國等亞洲患者的熱點變異位點[5]。R778L等位基因在韓國WD患者的攜帶率約為 37.9%、日本約為27%，中國約28%～44%[4，6，7]。c.2975C>T(p.Pro992Leu)突變位于ATP7B第8外顯子，蛋白的跨膜結構域。2013年，有學者報道了1例9歲的中國WD男童，攜帶與本文先證者相同的突變位點ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T[8]。該患者神經精神正常，本文中的先證者有明顯的神經精神癥狀；角膜K-F環陰性，本文患者陽性；肝功能指標ALT(137 IU/L)、AST(106 IU/L)明顯升高，本文先證者ALT(16 U/L，參考值5～35 U/L)、AST(22 U/L，參考值5～35 U/L)。有多位學者嘗試尋找患者基因型和發病年齡、性別、臨床表型的關系，但是沒有明確的結論[9～11]。最新研究顯示ATP7B DNA甲基化可能與患者臨床表型相關[12]。此外先證者4歲時曾患有病毒性腦炎，是否與患者的早期發病相關亦未可知。

先證者的母親攜帶ATP7B c.2333G>T突變，父親攜帶c.2975C>T突變。先證者從雙親遺傳到ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T符合雜合突變，結合患者臨床癥狀、生化檢查及體征，診斷WD明確。通過對先證者的弟弟ATP7B 基因21個外顯子和外顯子內含子銜接區的測序發現其只攜帶c.2333G>T突變，提示其弟弟的發病可能性不大，可密切隨訪觀察。

我們報告了一例早發型腦型WD家系，明確該家系WD發病的遺傳學基礎是ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T，并對先證者的弟弟進行突變檢測，分析其患病的可能性。