精子DNA碎片指數對體外受精胚胎及囊胚發育的影響

曲仕浩，羅英，周益平，鄭煜麗，徐楗熒*

(珠海市婦幼保健院 1.男性生殖健康科；2.生殖醫學中心，珠海 519000)

精子DNA碎片指數(DFI)是發生精子核DNA鏈斷裂的精子占全部精子的百分比。精子核DNA攜帶男方遺傳物質，其完整性對于遺傳信息的準確傳遞至關重要，它具有高度緊湊和復雜的結構，并且能夠消除精子的密集性，這是精子被認為具有繁殖能力所必須具備的特征。國內外多項研究已證實，任何形式的精子染色質異常或DNA損傷都可能導致男性不育，是評估男性不育的一個可靠指標[1-5]。Evenson等[6]首次將精子染色質結構分析系統參數用于男性生育力的評估，研究證實DFI≥15%時男性生育潛力明顯下降，≥30%為低度生育力，≥80%為無生育能力。精子DFI與卵裂期胚胎及囊胚發育之間的關系，目前仍沒有一致的結果。本研究對常規體外受精(IVF)患者的精液標本進行DFI檢測，探討其對IVF胚胎及囊胚發育的影響。

一、對象與方法

1.研究對象：選擇2017年1月至2020年12月在珠海市婦幼保健院生殖醫學中心接受常規體外受精(IVF)助孕的1 411個周期。納入標準：女方年齡22～38歲；月經周期規律，血清FSH<10 U/ml；獲卵數≥5 枚；男女雙方染色體檢查正常；臨床資料齊全。排除標準：合并內、外科手術及IVF禁忌癥者；子宮內膜異位癥、排卵障礙；黃體期促排卵；移植失敗周期>2次；因各種原因未完成控制性促排卵(COS)者。依據DFI分為A組(DFI<15%)、B組(15%≤DFI<30%)、C組(DFI≥30%)。

2.實驗方法：應用精子染色質擴散法(SCD)檢測精子核DNA的完整性，試劑盒購自深圳華康生物醫學工程有限公司，具體操作參照說明書。

3.DFI結果判定標準：根據暈環與精子頭部直徑比例，分為大暈環、中暈環、小暈環、無暈環以及退化精子。計算公式[7]：DFI=(小暈環+無暈環+退化)精子/計數精子總數×100%。

4.IVF助孕：應用本中心常規的超排卵方案，給予基因重組FSH(rFSH，默克雪蘭諾，德國)和/或尿源性FSH(uFSH，珠海麗珠)進行控制性促排卵，定期行B超監測卵泡發育。當至少有1個主導卵泡直徑≥18 mm或至少2個主導卵泡直徑≥17 mm時，注射重組人絨促性腺素(艾澤，默克雪蘭諾，德國)250 μg，36～38 h后行陰道超聲引導下取卵術。將卵母細胞置于培養箱(37℃、6% CO2)中培養3～6 h后行IVF，定期觀察受精卵原核、胚胎或囊胚形成情況。

5.數據統計定義[8]：卵裂胚胎率=D3卵裂胚胎數/2PN數；優質胚胎率=優質胚胎數/卵裂胚胎數×100%；囊胚形成率=囊胚數/卵裂胚胎數×100%。

二、結果

1.各組患者一般情況比較：各組女方平均年齡、體質量指數(BMI)、不孕年限、獲卵數及男方平均年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；隨著DFI升高，精子濃度、前向運動精子率(PR)和正常形態精子率均呈顯著下降趨勢(P均<0.01)(表1)。

表1 一般情況比較

2.各組患者胚胎及囊胚發育情況比較：隨著DFI升高，各組的受精率、2PN受精率、卵裂胚胎率及囊胚形成率均呈下降趨勢。B組和C組的受精率、卵裂胚胎率均顯著低于A組(P均<0.01)；C組的2PN受精率顯著低于A組和B組(P<0.01)；B組和C組囊胚形成率顯著低于A組(P<0.05)。各組的卵裂率及優質胚胎率相比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)(表2)。

表2 三組胚胎及囊胚發育情況比較(%)

三、討論

一直以來，男性生育力的評估主要依賴于精子濃度、活力及正常形態等傳統指標。近年來隨著生命科學領域的進展和自動化儀器的普及，男科學也從簡單和主觀的計數及形態學觀察，逐步進入到更為客觀的生化分析階段。精子DFI檢測逐步在男科臨床檢驗領域得到發展，在一定程度上從分子水平反映了男性生殖能力遺傳結構基礎和功能完整性[9]。

環狀結構、螺線管結構和核基質結合域是人精子染色質的3個主要結構，這些結構與功能密切相關。精子DFI指數升高的發生機制主要有以下幾個方面[10-12]：(1)控制凋亡的基因Fas、Bcl-x及p53等基因異常表達，細胞凋亡發生異常，從而不能及時去除DNA受損的精子，增高DNA碎片化導致精子DFI指數升高；(2)魚精蛋白在維持精子正常形態DNA和完整性有著至關重要的作用，其自身缺陷或功能異常時精子染色質濃縮過程異常，導致精子DFI指數升高；(3)當 ROS過多和抗氧化酶的平衡失調時，精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂導致精子DNA受損，受損傷的精子更容易受到ROS的攻擊，形成惡性循環，從而加重了精子DNA 損傷程度。有研究顯示，精子DFI指數與精子活力、前向運動率呈負相關，DNA損傷嚴重的精子引起其線粒體呼吸代謝功能明顯降低，精子DNA損傷可能是導致弱精子癥的重要原因之一[13-15]。本研究顯示，隨著DFI升高，精子濃度、前向運動精子率和正常形態精子率均呈下降趨勢。

關于精子DNA損傷是否影響胚胎的質量目前尚存在爭議，而且精子DNA損傷影響胚胎質量的機制仍不清楚。有觀點認為，精子染色質的異常導致胚胎質量下降，精子DNA損傷會降低精子受精能力和胚胎發育潛能，精子DNA損傷與受孕率和胚胎質量呈負相關關系，從而降低妊娠率，并且肯定了精子DFI對男性不育結局的預測價值[16-18]；但也有研究顯示，DFI與卵胞漿內單精子注射(ICSI)受精率、卵裂率、優胚率均無相關性[19]。本研究顯示，胚胎、囊胚發育情況比較，受精率、2PN受精率、卵裂胚胎率及囊胚形成率隨著DFI升高均呈下降趨勢(P<0.05或P<0.01)；但隨著DFI升高，各組的卵裂率及優質胚胎率的差異均無統計學意義(P>0.05)。精子DNA損傷能夠廣泛地影響胚胎受精、細胞分裂及發育等多個過程，胚胎自身有一定的自我修復能力，當DFI高的精子與卵母細胞受精后，卵母細胞將啟動DNA修復程序，但嚴重的DNA損傷卵母細胞無法修復，通過激活凋亡通路誘導胚胎凋亡，從而影響胚胎的發育[20]。

因此，本研究探討了精子DFI對IVF胚胎及囊胚發育的影響，精子DFI升高對男性精子產生負面影響，導致IVF受精率、卵裂胚胎率及囊胚形成率均下降，提示在常規IVF周期前檢查精子DNA碎片率具有臨床應用價值。