基于生物信息學方法對結直腸癌組織差異表達關鍵基因的篩選

馮彥超 ，應偉 ，李文菠 ，李雪 ，周國俊 ，洪瀟 ，陳科 ，周佳雨 2，，田奕洋 2，，冷政偉

1 川北醫學院附屬醫院肝膽外二科，四川南充637000；2 川北醫學院附屬醫院腫瘤干細胞研究中心；3 川北醫學院臨床醫學院

結直腸癌（CRC）是全世界發病率排名第三的惡性腫瘤，每年導致全世界近90 萬人死亡［1］。目前針對CRC 主要采用綜合治療的方法，但是晚期CRC 患者的總體生存率仍然很低。基因突變與失活在CRC 的發生發展過程中具有重要作用，所以針對CRC 的早期診斷及精準治療可大大提高CRC 患者的生存率，但是目前CRC 的有效治療靶點很少并且缺少簡單的靶點篩選方法。生物信息學方法具有樣本量大、成本低、簡潔高效等優點，近幾年通過生物信息學方法篩選出了很多CRC 發生發展中的關鍵基因。有研究通過基因表達數據庫（GEO）發現，SPINK4表達下調與CRC患者預后不良相關，并認為該基因可作為CRC的一種新型生物標志物［2］。還有研究通過篩選CRC 基因表達數據發現，轉錄因子ZBTB18 可以促進CRC 細胞的侵襲與遷移，可能參與了 CRC 的轉移［3］。2020 年 6 月—2021 年 7 月，本研究分析了CRC 組織和癌旁組織基因芯片中的基因表達情況，篩選出的差異表達基因（DEGs）即為CRC 發生發展中的關鍵基因，為CRC 的早期診斷及靶向治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據信息 從GEO（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/geo）中下載 3 個 CRC 芯片，即GSE71187、GSE31905、GSE35279，3個芯片中分別包括CRC 組織47、55、74 例份，癌旁組織12、7、5 例份。上述芯片均來自同一平臺（GPL6480），并使用相同的探針技術以減少不同實驗平臺之間檢測技術所引起的實驗誤差。

1.2 DEGs 及共表達DEGs 篩選 使用GEO 在線分析 工 具 GEO2R（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/geo2r/）對上述基因芯片進行分析，篩選并定義∣logFC∣≥2且校正P＜0.05的基因為DEGs，并定義log-FC≥2 為上調 DEGs，logFC≤-2 為下調 DEGs。通過Venn 在線網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）繪制Venn圖，篩選出共表達DEGs。

1.3 基因本體（GO）功能與KEGG 通路富集分析 通過生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov）對篩選出來的共表達DEGs進行生物學功能注釋，種屬選擇Homo sapiens，得到GO功能及KEGG 通路富集分析結果。以P＜0.05 且FDR＜0.05 為差異有統計學意義，選擇分析項目為生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC）和信號通路。

1.4 核心DEGs 的篩選 將篩選出的共表達DEGs上傳至STRING 在線網站（https：//string-db.org），繪制蛋白—蛋白相互作用網絡圖（PPI）。將得到的PPI 使 用 Cytoscape3.7.2 軟 件 及 MCODE 插 件 分 析后，得到PPI 中聯系最為緊密的核心網絡，將這些核心網絡所涉及的DEGs 定義為核心DEGs。MCODE分析設置條件：度數截斷值=2，節點分數截斷值=0.2，K-分數=2，最大深度=100。

1.5 核心DEGs 對患者預后的影響及其在CRC 組織中的表達驗證 在基因表達譜數據動態分析網頁工具（GEPIA，http：//gepia. cancer-pku. cn）網站中，選擇總生存期（OS）為指標，癌癥名稱選擇結腸癌和直腸癌，作出每個核心DEGs 影響OS 的生存曲線圖，篩選出生存分析中P＜0.05 的基因，即為預后相關基因。同時在GEPIA 網站中利用Box Plots 對預后相關基因進行表達量的驗證，癌癥名稱選擇結腸癌和直腸癌，在結腸癌和直腸癌任意一個中的表達具有統計學意義（P＜0.05）即為符合要求，篩選出與GEO 中表達量一致的基因，即為CRC 發生發展中的關鍵基因。

2 結果

2.1 DEGs 篩選結果 從3 個基因芯片中篩選出DEGs 5 664 個，其中上調 DEGs 2 703 個、下調 DEGs 2 961 個。通過Venn 圖篩選出共表達DEGs 390 個（OSID 碼圖1），其中上調基因207 個［差異最顯著的前5位分別為基質金屬蛋白酶7（MMP-7）、角蛋白23（KRT23）、二肽酶1（DPEP1）、角蛋白80（KRT80）、叉頭框蛋白Q1（FOXQ1）］、下調基因183 個［差異最顯著的前5 位分別為碳酸酐酶1（CA1）、胰高血糖素（GCG）、酶原顆粒蛋白 16（ZG16）、胰島素樣肽5（INSL5）、鳥苷酸環化酶激活劑2B（GUCA2B）］。

2.2 GO 功能與KEGG 通路富集分析結果 GO 功能分析結果：①BP 共涉及117 個方面，主要有碳酸氫鹽運輸、一碳代謝過程、氨基酸運輸、細胞對腫瘤壞死因子的反應、消化、膠原蛋白分解代謝過程、細胞外基質的組織及蛋白水解作用等；②CC共涉及21個方面，主要有細胞外空間、基底膜、頂端質膜、細胞外基質、蛋白質的細胞外基質、膜的錨定構件、分泌顆粒、質膜的組成部分、漿膜等；③MF 共涉及28 個方面，主要有激素活性、碳酸酐酶活性、特殊序列DNA 結合、肝素結合、細胞外基質結構成分、氨基酸跨膜轉運體活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性等方面（表1）。KEGG 通路富集分析結果：共涉及13 個方面，主要有氮的代謝、近端小管對碳酸氫鹽的重吸收、細胞色素P450與藥物代謝、胰腺分泌、化學物質的致癌作用、細胞色素P450 對外源生物的代謝作用、阿米巴病、ECM 受體的相互作用、PI3K/Akt信號通路等（表2）。

表1 共表達DEGs的GO功能分析結果（按P值排序的前5位）

表2 共表達DEGs的KEGG通路富集分析結果

2.3 核心DEGs 的篩選結果 390 個共表達DEGs提交至STRING 在線網站后，沒有出現在PPI網絡中的DEGs 26個，剩余DEGs 364個，不同蛋白之間的作用關系線738條（OSID碼圖2）。PPI中聯系最為緊密的核心網絡共7 個，其涉及的核心DEGs 66 個，其中上調DEGs 33個、下調DEGs 33個（OSID碼圖3）。

2.4 核心DEGs 對患者預后的影響及表達驗證結果 66 個核心DEGs 中有12 個［分泌型磷蛋白1（SPP1）、血小板反應蛋白2（THBS2）、氯化物通道附件 1（CLCA1）、接觸蛋白3（CNTN3）、GCG、ZG16、癌胚抗原相關細胞黏附分子7（CEACAM7）、細胞趨化因子8（CXCL8）、蛋白質透明同源物3（DIAPH3）、酪氨酸蛋白激酶（MET）、過氧化物酶體增殖活化受體（PPARGC1A）、溶質載體家族26 成員3（SLC26A3）］對患者OS 的影響具有統計學意義（P均＜0.05），見OSID 碼圖4。在GEPIA 和GEO 中表達量一致的核心 DEGs 共 6 個［上調 DEGs 2 個（SPP1、THBS2）、下調 DEGs 4 個（CLCA1、CNTN3、GCG、ZG16）］，見OSID碼圖5。

3 討論

目前認為，CRC 的發生發展涉及到生活方式、飲食習慣、腸道微生物菌群、遺傳、基因等多種因素［4-6］。晚期CRC 因其容易轉移復發，所以總體生存率很低。目前隨著生物信息學的發展及高通量基因芯片的廣泛應用，使得我們在篩選疾病發生發展中的關鍵基因時，又有了一個強有力的工具。本研究使用生物信息學的方法從GEO中篩選出3個大樣本量的CRC 和癌旁組織芯片，并通過多個權威的生物信息學網站進行了全面而系統的篩選及分析，最終得出了CLCA1、CNTN3、GCG、ZG16、SPP1、THBS2 基因與CRC 的發生發展具有重要關系，為CRC 的臨床早期診斷及治療提供了可能的靶點。

CLCA1 可調控 Ca2+依賴的 Cl－轉運，涉及通道蛋白跨膜蛋白16A（TMEM16A）及其附屬分子。CLCA1 調節上皮細胞氯電流，參與黏液高分泌相關呼吸道和胃腸道疾病的發病，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、肺炎、結腸直腸炎、囊性纖維化腸黏膜疾病、潰瘍性結腸炎等疾病［7］。CLCA1 在多種腫瘤組織中均有表達。HU 等［8］通過組織微陣列分析和免疫組織化學方法對140 例手術切除的胰腺癌標本進行分析，并對患者進行隨訪，證明CLCA1 在胰腺癌組織中表達陽性，且CLCA1 低表達是胰腺癌患者無病生存率低的獨立影響因素。LI等［9］研究表明，CRC 組織中 CLCA1 表達顯著降低，CLCA1 表達升高可以抑制CRC 細胞的侵襲能力；此外，CLCA1可能通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路和上皮—間質轉化（EMT）過程而發揮腫瘤抑制作用。

CNTN3 是主要表達于神經系統的Contactin 家族成員之一，可能在特定神經元網絡的形成和維護中發揮作用。ZHU 等［10］研究表明，CNTN3 在多形性膠質母細胞瘤中的表達顯著下調，CNTN3 表達較低的患者OS 顯著縮短，且CNTN3 可能與受體酪氨酸蛋白激酶（ErbB）信號通路相關。ZHOU 等［11］通過生物信息學的方法證明，CNTN3、SLC1A1、SLC16A9 對CRC 具有較高的診斷價值，但并未深入探究這3 個基因的作用機制。由此可見，CNTN3 不僅在神經系統疾病的發生中發揮重要作用，在CRC的發生發展中也具有重要作用，但目前對CRC 與CNTN3 關系的研究還比較少，且沒有相關作用機制的研究。

GCG 可作用于肝細胞，促進cAMP 依賴性機制，該機制參與下調脂肪生成酶和膽固醇合成，同時上調肝臟LDL 受體和IGF-Ⅰ拮抗劑IGFBP-1 的產生。KOLB 等［12］提出，GCG/胰島素可作為診斷新發糖尿病患者胰腺癌的潛在生物標志物。有研究通過生物信息學方法驗證了GCG 在CRC 組織與癌旁組織中的表達具有差異性，并且認為GCG 可能是CRC 患者的預后標志物或治療靶點［13-14］。目前對GCG 與各種癌癥關系的研究比較少，GCG 與CRC 關系的研究多是采用生物信息學的方法，缺少基礎實驗與作用機制的相關研究。

ZG16具有類似Jacalin 的凝集素結構域，主要由黏液分泌細胞表達，包括腸道中的杯狀細胞，而凝集素在免疫調節中具有重要作用［15］。ZG16 在人類多種腫瘤組織中均有表達。NI等［16］研究發現，ZG16表達可能與肺腺癌患者的預后相關。MENG 等［17］研究表明，ZG16 表達缺失與 CRC 高度相關，其在 CRC 的免疫反應調節中起重要作用；ZG16 與CRC 患者PDL1 表達呈負相關關系，ZG16 過表達阻斷了CRC 細胞中PD-L1的表達；此外，ZG16過表達可促進NK 細胞的存活和增殖，ZG16 和PD-L1 之間的強相關性表明ZG16 可以作為一種生物標志物用于對從免疫治療中受益的患者進行分層。

SPP1 也稱為骨橋蛋白（OPN），是一種整合素結合蛋白，由巨噬細胞、內皮細胞和破骨細胞等多種細胞分泌。SPP1 參與多種生理和病理過程，與腫瘤發生和轉移過程中的細胞生長、黏附和侵襲顯著相關，并且在肺癌［18］、結腸癌［19］等腫瘤組織中過度表達。XU 等［20］認為，SPP1在CRC 組織中表達顯著上調，且SPP1 可通過激活EMT 促進CRC 轉移，這可能是CRC 患者的一個潛在治療靶點。CHENG 等［21］研究認為，SPP1可促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲，并通過激活 PI3K/Akt-GSK/3β-β-catenin 通路而發揮作用。

THBS2 作為THBS 家族的一員，參與多種生物學過程，如細胞凋亡、傷口愈合、血管生成和炎癥反應，并表達于多種腫瘤細胞中［22］。目前，關于THBS2 在胃癌和CRC 中的研究比較多且比較深入。AO 等［23］研究表明，THBS2 在胃癌組織中高表達，可通過PI3K/Akt 信號通路促進胃癌細胞增殖、遷移。XU 等［24］研究表明，THBS2 在 CRC 組織中高表達，且THBS2/TLR4 軸有助于缺氧誘導因子 1α（HIF-1α）衍生的糖酵解，并最終促進CRC進展。

綜上所述，本研究采用生物信息學的方法篩選出 CLCA1、CNTN3、GCG、ZG16、SPP1、THBS2 等6 個基因可能是CRC 發生發展中的關鍵基因，有望成為CRC早期診斷及治療的新靶點。