FABP4對小鼠心室肌細胞收縮功能及鈣瞬變的影響

王翠華，王煒 ，劉剛，姜璇，尹亞娟，鄭明奇

1 河北醫科大學第一醫院康復醫學科，石家莊050030；2 河北醫科大學基礎醫學院生理教研室；3 河北醫科大學第一醫院心臟中心

脂肪酸結合蛋白（FABPs）是一類小分子蛋白質，相對分子質量14～15 kDa，主要參與長鏈脂肪酸的結合和轉運［1］。目前，已經在人類中發現了至少9種FABPs 家族成員，其中脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白也稱FABP4，高度表達于脂肪細胞和巨噬細胞中，在2 型糖尿病及代謝綜合征的發生發展中具有關鍵作用［2-5］。近年來，FABP4 被認為是預測急性冠脈綜合征患者預后的生物標志物［6］。動物實驗也發現，FABP4缺乏可延緩冠狀動脈粥樣硬化性小鼠疾病的發生發展，表明FABP4參與了心血管疾病的進展［4］。心血管疾病如心衰發生時，心臟的興奮—收縮耦聯和收縮蛋白功能均出現異常［7］。鈣瞬變是心肌細胞在興奮—收縮耦聯過程中細胞質鈣濃度的瞬時性變化，鈣瞬變的幅度大小可影響心肌細胞的收縮強度，兩者呈正相關關系［8］。目前，關于FABP4在細胞水平對單個心肌細胞收縮力的影響鮮見報道。2020 年1月—12月，本研究采用鈣成像技術和單細胞可視化功能檢測系統觀察FABP4對成年小鼠心室肌細胞收縮功能和鈣瞬變的影響，為進一步研究FABP4 對小鼠心肌興奮—收縮耦聯的影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級 C57BL/6 小鼠 76 只，雌雄不限，12～14 周齡，由河北省實驗動物中心提供。所用實驗動物均符合美國國立衛生研究院頒布的《實驗動物管理和使用指南》，實驗方案獲得河北醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 FABP4 重組蛋白購自美國Cayman 公司，Ⅱ型膠原蛋白酶購自美國ROCHE 公司，Pluronic F-127 購自美國Nalgene 公司，其余Fluo-4 AM、Creatine、Taurine 等主要試劑均購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡購自美國Leica 公司，IonOptix 單細胞動緣檢測系統購自美國IonOptix 公司，體式顯微鏡購自日本Olympus 公司，電刺激儀購自美國Thermo 公司，正置顯微鏡購自美國Leica公司等。

1.1.4 相關溶液配制 KB solution 的配制（單位均為mmol/L）：Na-β-OH-Butyric Acid 5，Na-Pyruvic Acid 5，Taurine 20，EGTA 0.5，NaOH（EGTA）1.09，Mg-SO4·7H2O 5，HEPES 5，glucose 10，KCl 90，Creatine 5，K2HPO430，用 NaOH 調整 pH 至 7.4。無鈣 Tyrode's solution 的配制（單位均為mmol/L）：MgCl210，NaCl 1 373，KCl 54，NaOH 27，Glucose 100，Glucose 5，稀釋 10 倍。1.8 mmol/L Ca2+Tyrode's solution 的配制：將 2 mol/L CaCl290 μL 加入到 Tyrode's solution 100 mL中，濃度為1.8 mmol/L。

1.2 小鼠心室肌細胞的急性分離 打開恒溫水浴箱，將Langendorff 裝置溫度調整為37 ℃，用無鈣Tyrode's solution逆行灌流，排空氣泡，再將含有Ⅱ型膠原蛋白酶（0.4 g/L）的無鈣 Tyrode's solution 倒入Langendorff 裝置中，用于消化小鼠心臟。將小鼠麻醉后開胸取出心臟，迅速置于無鈣Tyrode's solution中，在體式顯微鏡下修剪肺等多余組織，僅保留小段主動脈。將心臟的主動脈口快速懸掛于Langendorff裝置上，用含有Ⅱ型膠原蛋白酶的Tyrode's solution循環灌流20～35 min，當灌流速度增快至無法計數且心臟顏色變淡、用手觸之松軟時結束灌流。取下心臟，放置在KB solution中，緩慢輕柔沖洗殘余膠原酶液，在顯微鏡下去除主動脈弓、心房、心耳等組織。將僅留有左心室的心臟剪成細小碎塊，用吸管輕柔吹打至單個心室肌細胞，200 目篩網過濾后，將心肌細胞懸液于室溫靜置約40 min。

1.3 細胞分組與處理方法 將心肌細胞懸液分為觀察組和對照組，兩組均加入1.8 mmol/L Ca2+Tyrode's solution，觀察組在此基礎上分別給予0.05、0.5、5、50 nmol/L FABP4，孵育10 min。

1.4 細胞收縮功能測量 取兩組細胞，置于顯微鏡載物臺中的浴槽內，利用IonOptix 單細胞動力檢測系統測量細胞的收縮功能。給予15 V、10 ms、1 Hz電場刺激，先在10×鏡下找到收縮狀態達到實驗要求的細胞，再調至40×鏡，將細胞收縮影像傳輸到IonOptix 的MyoCam 照相系統并呈現在監視器上。由計算機自動實時采集并記錄心肌細胞收縮幅度（ΔSL%）、收縮最大速率（Max dv/dt）及收縮最大速率時間（Time of Max dv/dt）。

1.5 細胞鈣瞬變的動力學測量 采用鈣成像技術。取500 μL 心肌細胞懸液，分別加入Fluo-4 AM和 Pluronic F-127 各 1 μL，充分混勻，避光靜置 40 min。去除上清液，參照1.3 進行細胞分組處理，孵育10 min。取1 mL 細胞懸液，加入激光共聚焦顯微鏡的浴槽內，待細胞狀態穩定后分別給予10 V、10 ms、1 Hz電刺激，采用線掃模方式記錄鈣敏感的熒光信號。選擇穩定的心肌細胞記錄鈣瞬變，并通過Image J 軟件分析鈣瞬變幅度（ΔF/F0）和鈣回收速率（τ）。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞收縮功能相關指標比較 與對照組比較，加入不同濃度FABP4 的觀察組細胞ΔSL%均降低，以加入50 nmol/L FABP4 的觀察組細胞降低最明顯（P均＜0.05）；除加入 0.05 nmol/L FABP4外，其余加入不同濃度FABP4 的觀察組細胞Max dv/dt 均降低（P均＜0.05）。與對照組比較，僅加入50 nmol/L FABP4 的觀察組細胞Time of Max dv/dt降低（P＜0.05），加入其他濃度FABP4 的觀察組細胞 Time of Max dv/dt 均無明顯變化（P均＞0.05）。見表1。

表1 兩組細胞收縮功能相關指標比較（-x±s）

2.2 兩組細胞鈣瞬變相關指標比較 與對照組比較，加入5、50 nmol/L FABP4的觀察組細胞ΔF/F0均降低（P均＜0.05），加入不同濃度FABP4的觀察組細胞τ均無明顯變化（P均＞0.05）。見表2。

表2 兩組細胞鈣瞬變相關指標比較（）

表2 兩組細胞鈣瞬變相關指標比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組0.05 nmol/L 0.5 nmol/L 5 nmol/L 50 nmol/L對照組ΔF/F0τ（F/s）0.124±0.009 0.116±0.007 0.120±0.006 0.135±0.015 0.107±0.004 1.91±0.04 1.93±0.03 1.92±0.03*1.83±0.05*2.01±0.03

3 討論

以往研究發現，FABP4 在肥胖和代謝綜合征的發病過程中發揮重要作用，缺乏FABP4 的小鼠盡管極端肥胖，卻沒有出現胰島素抵抗或者糖尿病，這與FABP4 缺乏的小鼠未能在脂肪組織中表達胰島素抵抗相關因子有關［4，9］。近年來，FABP4 在心血管系統中的作用也越來越受到關注。研究證實，給予FABP4 抑制劑后，動脈粥樣硬化小鼠的動脈硬化情況較前明顯改善［10-11］。在人類中，血清FABP4 水平與左心室肥厚及心臟收縮功能障礙相關［12］。在冠心病患者中，FABP4 與左心室功能障礙和心肌灌注異常呈正相關關系［13］。LIU 等［14］研究顯示，心衰患者血清FABP4 水平明顯升高，且這種相關性隨著心衰程度加重而顯著增加。有研究發現，脂肪組織或巨噬細胞分泌的外源性FABP4 可以抑制心肌細胞收縮，并通過旁分泌作用影響肥胖和代謝綜合征患者的心臟功能［15］。

本研究觀察的收縮功能指標ΔSL%是細胞收縮幅度占單個細胞長度的百分比，可以更有效排除因單個細胞大小不同而導致的收縮幅度不同，能更準確反映心肌細胞的收縮能力。結果表明，FABP4 不僅可以抑制小鼠心室肌細胞的收縮幅度，而且隨著FABP4 濃度的升高，這種心肌細胞收縮幅度的抑制作用逐漸增強。本研究進一步分析了FABP4 對心室肌細胞 Max dv/dt 及 Time of Max dv/dt 的影響，發現FABP4 作用后的心肌細胞Max dv/dt 顯著下降，即在相同時間內，收縮最大速率下降導致收縮幅度下降，表明細胞收縮功能減弱。因此，我們推測FABP4 可通過降低細胞收縮的速率而抑制心肌細胞的收縮功能。

鈣瞬變是心肌細胞在收縮和舒張過程中細胞質鈣離子濃度的瞬時性增高，在興奮—收縮耦聯中發揮著重要的作用。心肌去極化時，L 型鈣通道（LTCC）開放，細胞外鈣離子進入細胞內，激活Ⅱ型雷諾丁受體（RyR2）；RyR2 位于肌質網上，是一種鈣釋放通道，RyR2 被激活后大量鈣離子釋放入細胞質，進而引起下游機制中肌鈣蛋白發生構象改變，產生肌絲滑行，細胞開始收縮。在心肌復極化時可激活肌質網鈣離子泵鈣ATP 酶（SERCA），SERCA 是一種鈣回收蛋白質，在興奮—收縮耦聯末將Ca2+回收入肌質網中，心肌細胞進入舒張過程。從心肌細胞的收縮和舒張過程可知，RyR2 和SERCA 在心肌細胞鈣瞬變過程中具有重要作用。在心力衰竭或心肌梗死時，心臟收縮能力的下降與心肌細胞Ca2+濃度改變及肌小節蛋白功能異常有關，而與LTCC 關系不大，心衰時RyR2和SERCA 功能均受到抑制，即心肌細胞ΔF/FO下降并且τ減低［16-17］。

本研究中由鈣成像技術檢測的鈣瞬變參數τ 可代表 SERCA 活性，τ 的大小與 SERCA 活性呈負相關關系。鈣瞬變幅度ΔF/F0代表小鼠心肌細胞內RyR2 活性，兩者呈正相關關系。本研究結果發現，低濃度FABP4對SERCA無抑制作用，在較高濃度時對RyR2 才有抑制作用，但這種抑制與對心肌細胞收縮的抑制相比明顯弱了很多，由此我們認為，FABP4 對心室肌細胞收縮能力的抑制作用幾乎不依賴于鈣釋放的調控，說明FABP4 并非通過鈣依賴性途徑，可能通過其他途徑抑制心肌細胞收縮。在興奮—收縮耦聯過程中，影響心肌細胞收縮功能的機制主要有上游機制（LTCC 調節機制）、中心機制（肌質網鈣釋放及鈣回收機制）及下游機制（肌小節蛋白調節機制）。LAMOUNIER-ZEPTER 等［15］研究報道，FABP4 對心肌細胞的收縮幅度有抑制作用，但對動作電位時程和LTCC 電流無顯著影響，我們的研究在此基礎上進一步發現FABP4 對鈣瞬變僅有較弱的抑制作用，因此推測FABP4 可能通過調節肌小節蛋白功能抑制心肌細胞收縮，為以后的深入研究提供了理論基礎。

綜上所述，FABP4 可通過降低細胞收縮速率而減小心肌細胞的收縮幅度，但對鈣瞬變的抑制作用較弱。FABP4 是否通過調節肌小節蛋白功能而抑制心肌細胞收縮，未來需進一步探討。